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elisa法测定克伦特罗残留量影响因子的研究 克伦特罗通常被称为“肉浓缩液”，这是国家明令禁止使用动物产品的药物之一。目前，elisa（免疫免疫）是一种快速筛选和检测动物肌肉、肝脏和尿液等克伦特罗残留的方法之一。与高效液相铬、气铬、气质等仪器的分析相比，具有操作简单、样品预处理快、样品分析时间短、成本低、环境污染小等优点。但在实际应用过程中，包括样品处理、样品准备、样品加工、热育种、外观评价等方面。每一步的操作不当将影响最终测量结果。为此，笔者在试验期间进行了ELISA测定畜产品中克伦特罗残留量影响因子试验研究，在实际操作过程中对相关步骤进行控制和注意，取得了较好的测定效果。 1 测试方法 1.1 目前临床研究中的缺失菌株，包括抗体抑制剂 酶联免疫吸附试验是测定克伦特罗残留的一种常见方法，是利用抗原抗体的特异性反应，以酶催化底物等作为显示系统，用微孔板等作为反应、分离载体的一种生物学检测方法。 1.2 移液器、多道移液器 美国BIO-RAD550型酶标仪，单道移液器20、100、1 000、5 000μL，多道移液器300μL，德国拜发C18柱、离心机、振荡器。 1.3 免疫、酶标记物工作液、复合液、水 试剂盒A：包括96孔酶联板、克伦特罗系列标准溶液（浓度为0、100.0、300.0、900.0、2 700.0、8 100.0μg/L），抗体工作液、酶标记物工作液、发色剂、反应停止液、缓冲液。德国拜发克伦特罗检测试剂盒。 试剂盒B：包括96孔酶联板、克伦特罗系列标准溶液（浓度为0、100.0、300.0、900.0、2 700.0、8 100.0μg/L），抗体浓缩液、酶标记物工作液、底物液A液、底物液B液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液。北京望尔生物技术有限公司克伦特罗检测试剂盒。 1.4 试剂 甲醇：分析纯氢氧化钠、正己烷、50 mM盐酸，pH3.0 50 mM磷酸二氢钾缓冲液，pH 3.0 500 mM磷酸二氢钾缓冲液。 1.5 样品制备 1.5.1 尿中的液体 取离心或过滤至清亮的猪尿直接测定。 1.5.2 木心柱的制备 取5 g粉碎样品，加入25 m L 50 mM HCl混合，振荡2 h，达到均质。取6 g均质品加入离心瓶，在10～15℃条件下离心15 min，每分钟4 000转以上。转移上清液到另一个离心瓶，加入300μL 1 N氢氧化钠混合15 min，加入4 mL500 mM磷酸二氢钾缓冲液pH 3.0，混合在4℃保存12 h。在10～15℃条件下离心15 min，每分钟4 000转以上，分离上清液。温度升至室温，上柱，用3 mL甲醇洗涤柱子，流速为1滴/s。用2 mL pH 3.0 50 mM磷酸二氢钾缓液洗涤柱子。样品进柱子，再用2 mL pH 3.0 50 mM磷酸二氢钾缓冲液洗涤柱子，用空气或氮气吹2 min干燥柱子，用1 mL甲醇洗涤柱子。在50～60℃弱空气下蒸发溶剂，用1 mL蒸馏水溶解干燥的残留物，待测定。 1.6 克伦特罗抗体的制备 将试剂盒温度平衡至室温20～22℃，按照布板说明准确取出所需试验的微孔布板，向酶标板孔中依次加入标准品和样品各20μL，分别依次加入克伦特罗抗体，37℃环境中反应30 min。洗板，加入酶标记物，37℃环境中反应30 min。洗板，加入底物，37℃环境中反应15 min。加入反应终止液。放入酶标仪450 nm处进行读数，最后用酶标仪专用软件进行计算。 2 加标回收率的前处理控制 由表1可以看出，当浓度为0.1～8.1μg/L时，试剂盒A与试剂盒B变异系数分别为0～0.5%与0～0.4%范围之间，即在同一条件下，试剂盒A与试剂盒B均能达到较好的灵敏度。由表2可以看出，试剂盒A与试剂盒B添加浓度在0.25～1.0μg/kg之间，添加回收率均控制在61.03%～114.9%有效范围内。在进行以上试验过程中，要做到“三控”：控流速，控转速，控温度，即始终控制室温20～22℃，离心时温度10～15℃、速度为4 000转/min是1个重要的过程；其次，控制试剂和样品上柱时流速为1滴/s, 15滴/min，在前处理步骤中显得十分关键。在分析程序中，虽然洗板不是反应步骤，但却是决定试验成败的关键。目的是吸去反应液中没有与固相抗原或抗体结合的物质以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。洗板时应注意，甩干孔内反应液，洗涤液在板孔上方1 cm处注入，相互不得溅溢，洗涤液数量保证控制在250μL以上。放置10 s左右，吸干孔内液体，在吸水纸上拍干，次数为3次以上。洗板后应立即进行下一步操作，并保证枪头与移液器的紧密接触。 3 回收率及系数控制 通过上述方法可以很好提高酶联免疫分析吸附试验的准确性，将吸光度变异系数控制在有效范围内，并将添加回收率控制在有效范围内，确保分析数