生槟榔中生物碱与鞣质类成分对斑马鱼急性毒性的比较研究.docxVIP

? ? 生槟榔中生物碱与鞣质类成分对斑马鱼急性毒性的比较研究 ? ? 林青华，屈文佳，贾哲，徐新房，刘梦楠，贾天颖，周改莲，李向日,4* (1.广西中医药大学药学院，广西 南宁 530200；2.广西中医药大学 广西壮瑶药工程技术研究中心，广西 南宁 530200；3.北京中医药大学中药学院，北京 102488；4.北京中医药大学 中药品质评价北京市重点实验室，北京 102488) 斑马鱼是辐鳍亚纲鲤科短担尼鱼属的一种硬骨鱼，其基因与人类基因相似度达87%，而且对药物的反应也与人相似[1]。斑马鱼具有体外受精、发育,胚胎透明,试验周期短,样本量大等传统动物实验和细胞试验不可比拟的优势，现已成为一种在生物学领域广泛应用模式生物[2]，并在急性毒性、发育毒性、神经毒性、血管研究和癌症研究方面显现出广阔的应用前景[3-7]。 1 材料 1.1 药材 生槟榔购于北京同仁堂药材有限责任公司，经北京中医药大学李向日教授鉴定为棕榈科植物槟榔ArecacatechuL.成熟种子的炮制品，样品留样存放于北京中医药大学中药学院炮制教研室。 1.2 动物 AB型斑马鱼幼鱼(受精卵正常发育4天)由北京中医药大学中药学院提供，斑马鱼亲本购于中国科学院武汉水生生物研究所。 1.3 仪器与试剂 斑马鱼循环水养殖系统(北京爱生科技公司)，LRH-250 Z型恒温生化培养箱(广州沪瑞明仪器有限公司)，岛津LC-20 A高效液相色谱仪(LC-20 AD泵，SPD-20 A检测器，Lcsolution处理软件，岛津公司)，Ultimater?XB-SCX色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm，月旭科技)，紫外-可见分光光度仪(北京普析通用仪器有限公司)，FA-1004电子分析天平(上海天平仪器厂)，SB 25-12 DTDN型数控超声波清洗器(宁波新芝生物科技股份有限公司)。 没食子酸对照品(天津市光复精细化工研究所，批纯度99.0%)，槟榔碱氢溴酸盐(批号1391，纯度98.0%)购于上海施丹德生物技术有限公司，去甲基槟榔碱氢溴酸盐(批号Q-075-170930，纯度98.0%)、槟榔次碱盐酸盐(批号B-084-170928，纯度98.0%)购于成都瑞芬思生物科技有限公司，去甲基槟榔次碱盐酸盐(批号J纯度98.0%)购于湖北巨胜科技有限公司；乙腈(色谱纯，Fisher公司)；氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、硫酸镁、碳酸氢钠、氯化钙、盐酸、溴水、磷酸、氨水、石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮(北京化工厂)，碳酸钠、钨酸钠、硫酸锂(天津福晨化学试剂厂)，钼酸钠、明胶(天津市化学试剂厂)，干酪素(北京奥博星生物技术有限责任公司)，以上试剂均为分析纯。 2 方法与结果 2.1 斑马鱼的养殖与繁育 2.1.1 斑马鱼胚胎培养液的配制 按照Zebrafish Book标准，分别适量称取NaCl、KCl、Na2HPO4、K2HPO4、MgSO4、NaHCO3、CaCl2，最终配成每升含0.14 mol NaCl、5.4 mol KCl、0.25 mol Na2HPO4、0.44 mol K2HPO4、1.3 mol CaCl2、1.0 mol MgSO4和4.2 mol NaHCO3水溶液，即得斑马鱼胚胎培养液。 2.1.2 斑马鱼的养殖及繁育 斑马鱼在循环养殖系统中驯养，其水温为(28±0.5)℃，pH值7.0～7.2，电导率为450～550 μs/cm，每天黑暗环境(10 h)与光照环境(14 h)交替进行，以丰年虾幼虫喂食成年斑马鱼，每日3次。 暗周期开始前，将选取的雄性与雌性成年斑马鱼按照2∶1的比例放入产卵缸中，用隔板将其分开；暗周期结束后抽去隔板，雄鱼与雌鱼在光照刺激下完成交配，4 h后收集合格受精卵，将其用胚胎培养液清洗干净后转移到无菌培养皿中，置生化培养箱中孵育；每日上午更换胚胎培养液并及时除去死亡胚胎及胎衣，4 d后选取发育正常的斑马鱼幼鱼进行急性毒性研究。 2.2 试药制备 2.2.1 总生物碱的制备 称取生槟榔粉末(过80目筛)500 g，加10倍量去离子水，回流提取3次，每次1 h，合并提取液，减压浓缩至小体积，放冷；石油醚萃取3次，水层再用二氯甲烷萃取3次，合并二氯甲烷萃取液，减压回收溶剂，得二氯甲烷部位；二氯甲烷部位用去离子水复溶，滤除不容物，减压除去溶剂，得总生物碱部位(棕黄色的油状物)，备用。 2.2.2 总鞣质的制备 取生槟榔粉末100 g，加10倍量的80%丙酮超声提取2 h，滤除药渣，回收溶剂，得鞣质粗提物；将其用去离子水复溶并稀释至1 000 mL，静置，滤除沉淀，得鞣质粗提物水溶液；取明胶适量，制成1%的明胶水溶液，将其缓缓加入鞣质粗提物水溶液中，边加边搅，静置，离心(4 0