贵州产地刺梨果酒产酒精酵母的筛选及其发酵性能研究.docxVIP

? ? 贵州产地刺梨果酒产酒精酵母的筛选及其发酵性能研究 ? ? 张小勤，潘晓姗，李 东，蒋思峡，张 丰，安焱林，赵晶晶，宋 亚，喻仕瑞，张 阳，颜茹雨 （茅台学院 食品科学与工程系，贵州 遵义 564507） 刺梨（Rosa roxbunghii）为一种蔷薇科多年生落叶灌木缫丝花的果实[1]，是滋补健身的营养珍果，富含多种氨基酸和维生素C[2]，因其含有抗衰老和抗癌物质超氧化歧化酶（superoxide dismutase，SOD），被称为“长寿防癌”的绿色珍果[3]。我国贵州地区刺梨资源尤为丰富，产量全国领先[4-6]。近年来，刺梨特色产业迎来了前所未有的历史发展机遇[6-7]。目前，刺梨产品主要为原汁、饮料、果干、果糕和浸泡酒等，这些产品大多存在附加值偏低的缺点[8]。刺梨果酒历史悠久，早在清道光十三年便有记录[9]，目前刺梨果酒多以高度白酒浸泡[10-11]、商用酵母直接酿造[12-13]或用经驯化后的商用酵母酿造[14]，但受限于浸泡果酒口感粗糙不够柔和、缺乏刺梨果酒酿造专用酵母，在刺梨果酒酿造过程中未能很好的体现贵州产地刺梨果酒的特色和风格。 酵母是发酵酿制果酒中决定果酒品质优劣的核心要素，优良的刺梨果酒酵母菌应具有发酵速度快、产乙醇率高、耐受性好（耐糖、耐乙醇、耐SO2、耐酸等）、凝聚性好，发酵结束后能使酒快速澄清的特点[15]。目前，针对刺梨果酒酿造专用的产酒精酵母报道较少，基于此，本研究拟从贵州遵义、荔波、六盘水、都匀刺梨种植基地采集刺梨鲜果样品，采用孟加拉红培养基分离纯化、2,3,5-三苯基氯化四氮唑（2,3,5-triphenyte-trazoliumchloride，TTC）培养基初筛产酒精能力强的酵母菌株，结合杜氏小管产气实验和耐受性实验复筛发酵性能优良的酵母菌株，然后采用复筛菌株酿造刺梨果酒，测定果酒理化指标，最后基于26S rDNA基因序列对复筛菌株进行分子生物学鉴定。筛选出适合贵州地区刺梨果酒酿造的产酒精酵母，对改善刺梨果酒特色风味和品质具有重要意义。同时可提升刺梨的附加值，解决刺梨季节性过剩的问题，亦可丰富果酒市场，具有良好的社会效益和经济效益前景。 1 材料与方法 1.1 材料与试剂 1.1.1 材料 成熟新鲜刺梨：采自贵州遵义、荔波、六盘水、都匀刺梨种植基地。 1.1.2 菌株 商业酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）D524：上海康禧食品饮业有限公司。 1.1.3 培养基 孟加拉红培养基：杭州百思生物技术有限公司；TTC培养基：环凯微生物科技有限公司。 酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）液体培养基：蛋白胨20 g/L、酵母浸粉10 g/L，葡萄糖20 g/L，121 ℃高压蒸汽灭菌15 min。YPD固体培养基中添加琼脂粉20 g/L。 1.1.4 试剂 乙醇（分析纯）：南昌华鑫医药化工有限公司；盐酸（分析纯）：上海沪试实验室器材股份有限公司；氢氧化钠、酚酞、偏重亚硫酸钾（均为分析纯）：北京沃凯生物科技有限公司；无水葡萄糖、琼脂粉（均为生化试剂）：常德比克曼生物科技有限公司；酵母浸粉、蛋白胨（均为生化试剂）：北京奥博星生物技术有限责任公司。 1.2 仪器与设备 RE5RAA高压蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂；CV-5200PC分光光度计：上海元析仪器有限公司；BGG-9140A干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司；HZQ-C卧式恒温摇床：常州洛基仪器有限公司；DL-CJ-2NDI超净工作台：北京东联哈尔仪器制造有限公司；SHP-250生化培养箱：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；DKB24电热恒温水浴锅：上海森信实验仪器有限公司；FA2004W电子天平：上海菁海仪器有限公司。 1.3 方法 1.3.1 刺梨果酒产酒精酵母的富集 将采摘好的刺梨进行榨汁、过滤，所得的刺梨汁与刺梨渣各分装两份进行发酵，一份隔绝空气、一份不隔绝空气。相同条件下自然发酵7 d[16]。 吸取上述样品各5 mL分别放入100 mL YPD液体培养基中，并在28 ℃、220 r/min摇床中富集培养12 h。 1.3.2 刺梨果酒产酒精酵母的分离 在无菌操作条件下，使用梯度稀释法将富集培养好的菌液进行梯度稀释，各取0.1 mL稀释液涂布在孟加拉红琼脂培养基上，在28 ℃的培养箱中倒置培养48 h。观察菌落在孟加拉红琼脂培养基上的颜色形态以及隆起情况，选取明显是酵母菌的菌株，将其进行分离纯化，直到看到单个菌落[17]。 1.3.3 刺梨果酒产酒精酵母的形态观察及产酒精能力筛选 将筛选出的单个酵母菌菌落接种在YPD固体培养基上，于28 ℃培养箱中倒置培养48 h。通过观察酵母菌的形态特征，挑选出典型的酵母菌菌落（表面光滑、湿润、黏稠，质地柔