柴胡皂苷类化学成分含量测定及急性毒性比较研究.docx

柴胡皂苷类化学成分含量测定及急性毒性比较研究 柴胡被记录在《中国药典》2005年版中，是波形科植物柴胡（buurosenfederal）或星形柴胡（buurosenscorzerdifoliumwed.）的干燥根。根据其性质，第一种被称为“北柴胡”，第二种被称为“南柴胡”。南、北柴胡均做为正品载入药典,其性味苦,微寒,功效和解表里,疏肝,升阳。临床上两者皆可入药。柴胡总皂苷作为南、北柴胡的主要化学成分,是柴胡抗炎、抗病毒、抗肿瘤和提高免疫作用的有效成分,但也有报道称柴胡总皂苷是导致其毒副作用的化学成分。近年来,关于柴胡临床不良反应的报道日益增多,品种使用混乱是其中原因之一。根据既往文献报道,南、北柴胡在显微特征、化学成分种类和含量上存在一定差异,但在临床不良反应报道中,并未将两者区分开。为保障南、北柴胡的临床安全、合理应用,也为进一步研究影响柴胡的毒性物质基础与毒性机制的因素,必须首先明确药材基源、产地、采收、炮制、提取等中药特有因素对柴胡毒性的影响,还应探讨柴胡皂苷类化学成分与急性毒性的相关性。为此,本实验采用柴胡皂苷a为对照品,参照UV方法对南、北柴胡总皂苷含量进行了测定,并用HPLC检测法对南、北柴胡皂苷a含量进行测定,运用经典毒性实验法对南、北柴胡药材的急性毒性进行了对比研究。 1 试验材料 1.1 、北胡的制备 南柴胡(Bupleurum scorzonerifolium Willd.)、北柴胡(Bupleurum chinense DC.)粉碎,过120目药物筛,备用。药典规定人日用剂量为9g。供样批号均南、北柴胡药粉用蒸馏水分别配成0.21g/mL、0.22g/mL浓度的混悬液。 1.2 试验对象动物 昆明种健康小白鼠,雌雄各半,体重18~22g,共60只,购自山东大学实验动物中心,许可证号:scxk(鲁。 2 方法和结果 2.1 药品、化学品测定 紫外分光光度计:UV-2102(上海尤尼柯有限公司),柴胡皂苷a对照品(11077-200303,供含量测定用,中国药品生物制品检定所提供),试剂均为分析纯。南、北柴胡购自河北省安国药材批发市场。 2.1.2 对照溶液的制备 2.1.3 加甲醇预处理 精密称定样品0.12g,加甲醇20mL,密塞,称重,浸提48h,超声波振荡提取6次,每次30min,加甲醇补足至原来量,临用前过0.45μm的滤膜。 以甲醇5mL作为空白溶液,供试品溶液与对照品溶液各精密吸取0.2mL,分别加入1%对二甲氨基苯甲醛乙醇溶液0.1mL,70℃温热10min,取出放冷,加入磷酸4.0mL,70℃反应30min,放冷,即得。 2.1.4 重量测定 2.2 总皂苷,柴胡皂苷a含量 表1数据表明,南、北柴胡药材中柴胡总皂苷和皂苷a含量不同,柴胡总皂苷含量为北柴胡南柴胡,柴胡皂苷a含量北柴胡南柴胡。提示不同基原对柴胡皂苷类化学成分含量有影响。 2.3 柴胡皂苷a急毒小鼠一般情况和体重变化 按照急性毒性试验要求进行预试验,发现南、北柴胡药材粉碎物无法测出LD50,故进行1日内最大给药量试验。 取上述小鼠60只,禁食12小时后按体重随机分为北柴胡药材组、南柴胡药材组和水对照组。每组20只,北柴胡药材组给含生药量0.22g/mL浓度的混悬液,按0.4mL/10g鼠重灌胃,1日3次,使1日内给药剂量达26.4g/kg,南柴胡药材组给含生药量0.21g/mL浓度的混悬液,按0.4mL/10g鼠重灌胃,1日3次,使1日内给药剂量达25.2g/kg,空白对照组给等体积的水。各组给药灌胃后,每盒5只,正常饲养,药后2小时之内,每15分钟观察1次;药后2~4小时之内,每30分钟观察1次;药后4~8小时之内,每1小时观察1次;药后8~24小时之内,每4小时观察1次;药后第2天起,每天观察1次,称取体重,密切观察各小鼠的动度进食、饮水情况及7天内可能出现动度、异常肌肉运动、对外反应、瞳孔改变、异常分泌物、大小便异常、眼球凸出、眼睑下垂、呼吸异常、皮肤颜色改变等的毒性反应和死亡情况。实验结束后将小鼠处死进行解剖,观察小鼠心、肝、脾、肺、肾等重要内脏的大体的病理变化。 给药后,药物组小鼠于灌胃后2h见有腹泻,安静,毛色无光,未见其它异常表现。给药2天后,药物组逐渐好转,药后第7天,行为活动正常,无异常病理性神经反射出现,进食正常,未见其它异常表现,给药组小鼠每日体重均与水对照组进行组间t检验,急毒小鼠一般情况见表2,体重变化见表3。 表2数据表明,给药前北柴胡组和南柴胡组小鼠体重和水对照组小鼠体重比较无显著性差异,实验结束后北柴胡组和南柴胡组小鼠体重和水对照组小鼠体重比较也无显著性差异,且动物无死亡。其MLD剂量的高低与柴胡皂苷a含量大小变化相一致。 表3的数据表明,给药前北柴胡组和