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油茶叶枯病发生规律及防治对策 近年来，油茶叶片萎缩，导致果实和叶片掉落，严重影响了油茶生长，导致油茶产量下降，损害了当地的经济和生态效益。油茶叶枯病主要危害油茶叶、芽和果实。一般病株率为30%～50%,病害严重的达到90%以上;果的发病率为25%,病害严重的达到40%以上。该病引起油茶落叶、落果,最终影响油茶的产量和质量。李河等人对油茶叶枯病病原菌进行了分离和孢子形态观察,并利用分子生物学手段对其进行了鉴定,最后确定引起油茶叶枯病的病原菌为Pestalotiopsis microspora,即小孢拟盘多毛孢菌。然而,目前有关油茶叶枯病原菌生物学特性的研究尚未见诸报道。为此,笔者对影响油茶叶枯病病原菌菌丝生长的温度、光照、pH值和培养基进行了研究,以期了解油茶叶枯病原菌的生物学特性,为油茶叶枯病的前期研究奠定基础。 1 材料和方法 1.1 材料表面 油茶叶枯病病叶采自湖南省油茶示范基地。 1.2 方法 1.2.1 培养优势菌 取油茶叶枯病叶病健交界处组织,洗净病斑,表面晾干,用75%的酒精涂擦病斑,在无菌操作台中将发病组织依次放入75%的酒精,用0.1%的升汞消毒,无菌水冲洗3次,置于PDA平板上,20℃恒温下保湿培养6 d后用接种针转接至PDA平板上培养4 d,筛选出优势菌,将优势菌纯化3次后获得纯培养物。分离菌株保存于中南林业科技大学微生物菌种室内。 1.2.2 油茶叶从分生孢子盘培养 将纯化后得到的分离物转移至PDA培养基上继续培养,分生孢子盘(小黑点)产生后,用灭菌的挑针于灭菌的蒸馏水中挑取分生孢子盘,用挑针压破分生孢子盘使分生孢子释放出来,从而得到孢子悬浮液,其浓度为107～108个·mL-1。取健康的油茶叶,用灭菌小刀划一道10 mm的伤口,用取液器吸取10 μL孢子悬浮液至油茶叶伤口上,用无菌水代替孢子悬浮液作对照,用湿润的棉花覆盖伤口,外面用1 000 mL的烧杯罩住整片叶,在20～25℃下进行保湿培养。观察是否有症状出现及症状扩展情况,实验重复3次。 1.2.3 不同温度对菌落直径的测定 将活化的油茶叶枯病菌转接于PDA平板上,27℃下培养5 d,用打孔器从菌落边缘打取直径为6 mm的菌饼,将菌饼移接于PDA培养基上,然后分别置于0、5、10、15、20、25、27、31℃共8个温度梯度进行恒温培养,每个处理重复3次,第5天后用十字交叉法测量菌落的直径。 1.2.4 ph值对菌落直径的影响 用无菌NaOH(1 mol·L-1) 和HCl(1 mol·L-1) 调节PDA培养基的pH值,使之分别为4、5、6、7、7.5、8、9,并制成PDA平板,然后将6 mm的菌饼分别移接于不同pH值的培养基上,于25℃进行恒温培养,每个处理重复3次,第5天后测量菌落的直径。 1.2.5 灯光石构成水源 在PDA培养基平板上,接入直径为6 mm的菌饼,用普通日光灯(36 W,距离20 cm)作为光源。实验设连续强光光照、普通光照、12 h光暗交替、连续黑暗共4个处理,每个处理重复3次,于25 ℃恒温箱中培养,第5天后测量菌落的直径。 1.2.6 碳源的种类 以PDA培养基为基础培养基,分别采用葡萄糖、可溶性淀粉、蔗糖作为碳源。不同碳源的培养基各3 皿,每皿接入直径为6 mm的菌饼1个,放于25 ℃恒温箱中培养,第5天后测量菌落的直径,pH值恒定。 2 结果与分析 2.1 分生孢子盘的形态特征 油茶叶枯病原菌培养菌落近圆形,表面覆盖着粉红色茸毛状的气生菌丝,从培养皿背面可见菌落因分泌色素而呈橙黄色。20℃培养5 d后,菌落里面和菌丝表面可见散布的黑色小点即分生孢子盘。在显微镜下观察分生孢子盘和分生孢子的形态特征,分生孢子为纺锤形,5个细胞,长(18.5～20.5) μm×(6.4～7.0) μm;中间3个细胞呈橄榄色,3个有色细胞中的2个颜色较深,长12.8～16.4 μm,两端细胞为淡色;4个隔膜均为真隔膜,孢子顶端有2～3根不分支的附属丝,长15～17 μm;分生孢子梗较长,呈淡色,不分支,无隔膜。病原菌孢子的形态特征如图1所示。 2.2 分离的活性成分 将分离物接种到油茶叶15 d,接种叶出现了和初始感染的油茶叶一致的症状,对照没有症状出现的油茶叶,将接种发病油茶叶的病斑再一次分离,所得分离物的形态与第1次得到的分离物菌落一致,产生的分生孢子的形态也与第1次分离的分生孢子一致。 2.3 最适宜温度的确定 实验结果表明:油茶叶枯病病原菌菌丝在5～31℃之间均能生长,其中27℃的温度为菌丝生长的最适宜温度,在此温度下菌落直径达到了最大值,为65.28 mm;23～28℃的温度为菌丝生长的较适宜温度,接种第5天后菌落直径都在35 mm以上;当温度大于27℃时,菌丝生长开始减缓。温度对菌丝生长的影响情况如图2所示。 2.4 净生长