粉尘螨浸出液对小儿支气管哮喘体外刺激的研究.docxVIP

粉尘螨浸出液对小儿支气管哮喘体外刺激的研究 气管哮喘是由各种细胞和细胞组成的慢性呼吸道炎症疾病，其中t淋巴细胞对呼吸道炎症有主要的抑制作用。接触过敏原后淋巴细胞的增殖、分化及反应决定着过敏性哮喘的发展、变化和转归。常见的研究淋巴细胞功能的方法为给予淋巴细胞特异性或非特异性的刺激,如植物血凝素(PHA)等,检测刺激后淋巴细胞增殖及细胞因子分泌情况,从而了解淋巴细胞的功能。而对于有明确过敏原的支气管哮喘患儿给予特异性过敏原浸出液刺激则可能更接近于疾病的真实状况。因此我们拟观察对粉尘螨过敏的支气管哮喘患儿的外周血淋巴细胞在体外接受粉尘螨特异性变应原刺激后的增殖情况,确定粉尘螨特异性变应原刺激所需的最佳刺激浓度和刺激时间,从而为体外研究对粉尘螨过敏的支气管哮喘患儿淋巴细胞功能提供可靠的实验室方法。 1 数据和方法 1.1 对粉尘病 2010年1月至2011年1月我院收治的支气管哮喘患儿40例,根据2008年中华医学会儿科学会呼吸学组制定的《儿童支气管哮喘诊断与防治指南》中儿童支气管哮喘诊断标准,选择对粉尘螨过敏[粉尘螨过敏原皮肤点刺试验阳性,风团反应范围≥(++);粉尘螨特异性IgE≥0.7kU/L]的中度支气管哮喘患儿20例作为粉尘螨过敏组,男 11 例,女9 例,年龄3～13岁,平均(5.7±2.1)岁,病程(3.23±1.16)年,同时选择非粉尘螨过敏的中度支气管哮喘患儿20例作为非粉尘螨过敏组;男13 例,女7 例,年龄3～13岁,平均(5.6±2.3)岁,病程(3.59±1.89)年,两组患儿在性别、年龄、病程以及病情严重程度方面差异无统计学意义,具有可比性。 1.2 糖激素布地奈德 两组在采血前4周内未全身使用糖皮质激素及其他免疫抑制剂;两组的基础用药相同,均应用小至中等剂量的吸入型糖皮质激素(布地奈德吸入剂),必要时应用β2受体激动剂(硫酸沙丁胺醇吸入剂),不合并使用长效抗组胺及抗白三烯类药物。 1.3 变应原风团反应范围 过敏原皮肤点刺试验操作按国际标准方法进行。以变应原与组胺(阳性对照液)所致风团面积比确定其反应级别:①变应原风团反应与阴性对照相同为(-);②风团反应范围为阳性对照反应的25%～50%为(+);③风团反应范围为阳性对照的50%～100%为(++);④风团反应范围为阳性对照反应的100%～200%为(+++);⑤风团反应范围为阳性对照反应的200%以上为(++++)。(++)及以上者定为阳性。 1.4 不同途径输注rpmi1840培养基后细胞的细胞培养 采取外周静脉血4ml,肝素钠抗凝,应用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞并进行淋巴细胞活力检测(活力90%)。用含10%小牛血清的完全RPMI1640培养基调整淋巴细胞浓度为1×106/ml,接种于24孔细胞培养板内,将每例患儿的淋巴细胞平均分为8孔,每孔500μl,8孔粉尘螨浸出液抗原浓度分别为:0、5、10、20、40、60、80、100mg/L。于37 ℃5%二氧化碳(CO2)饱和湿度细胞培养箱中分别培养24、48及72小时后应用细胞计数试剂盒8(CCK-8)检测淋巴细胞增殖情况。 1.5 细胞控制液 ①分别于培养后24、48及72小时吸取各孔淋巴细胞50μl转入96孔细胞培养板中,各做3个复孔,并设空白对照孔,即孔内不含淋巴细胞,而仅含RPMI-1640培养基; ②每孔加入CCK-8试剂5μl,于5%CO2细胞培养箱内继续孵育2小时; ③应用全自动酶标仪在450nm测定吸光度,同时将650nm作为参考波长进行双波长测定。读取吸光度(A)值。按下式计算不同浓度户尘螨浸出液刺激淋巴细胞增殖的刺激指数(SI)。SI=(刺激孔A值-空白孔A值)/(未刺激孔A值-空白孔A值)。 1.6 均数标准差拟合 应用SPSS13.0统计软件处理数据,所有数据以均数±标准差(xˉ±s)(xˉ±s)表示,两组不同时点的比较采用重复测量的方差分析,P0.05为差异有统计学意义。 2 商业血药浓度对细胞增生si的影响 在接受户尘螨浸出液20 mg/L、40 mg/L刺激时,粉尘螨过敏组在培养24小时、48小时和72小时的过程中,淋巴细胞增殖的SI均呈先升高后降低的趋势,而在刺激物浓度为80 mg/L时,粉尘螨过敏组淋巴细胞增殖的SI则是逐渐降低的;在非粉尘螨过敏组,这种升高和降低的趋势不明显,两组在组间、不同时点以及组间和不同时点的交互作用中差异均有统计学意义(P0.05或0.01),粉尘螨浸出液刺激浓度为40 mg/L,培养48小时时的淋巴细胞增殖的SI最高,见表1。 3 cck-8实验方法主要引起受精神病理的细胞增殖,其符合现代各学发展的三大主要趋势 淋巴细胞在体外经某种物质刺激后其代谢及形态将相继发生变化,此为淋巴细胞转化试验,亦称淋巴细胞增殖试验。此过程首先表现为短时间内