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放射毛霉产中性蛋白酶培养条件优化 发酵食品在中国已有几千年的历史。发酵豆制品不仅味美、营养丰富, 而且具有降低胆固醇、降血压、抗氧化等多种保健功能。腐乳是在豆腐生产基础上发展起来的发酵型大豆食品之一, 在腐乳生产过程中有多种微生物和酶参与, 其共同作用造就了腐乳的独特风味, 也正因其独特的工艺、细腻的品质、丰富的营养及鲜香可口的风味深受消费者喜爱。腐乳发酵阶段可分为前期培菌和后期发酵。前期培菌是在半开放条件下培养微生物的酶系;后期发酵主要是酶系与微生物协同参与生化反应的过程。腐乳生产中所用的发酵菌种主要是毛霉, 如雅致放射毛霉 (Actinomucor elegans) 、五通桥毛霉 (wutungkiao mucor) 、腐乳毛霉 (Mucor sufu) 等, 它们具有分泌蛋白酶、肽酶及其他酶系的功能, 其中蛋白酶能进行蛋白质的降解。通过对毛霉菌株发酵培养条件的优化, 提高毛霉菌株产中性蛋白酶的酶活力, 其目的在于缩短腐乳发酵周期, 提高腐乳的生产效率。 1 材料和方法 1.1 gkioamocor菌株 雅致放射毛霉 (Actinomucor elegans) 菌种编号3118、五通桥毛酶 (Wutungkiao Mucor) 菌种编号40477:中国工业微生物菌种保藏管理中心;蔗糖 (分析纯) :北京奥博星生物技术有限公司;硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钙 (分析纯) :天津市天新精细化工开发中心;黄豆粉、磷酸缓冲液、TCA、福林酚、酪蛋白、碳酸钠、盐酸溶液、氢氧化钠 (分析纯) :西陇化工股份有限公司。 1.2 hzq-fps试验仪器 手提式压力蒸汽灭菌器:浙江新丰医疗器械有限公司;无菌操作台:北京东联哈尔仪器制造有限公司;HZQ-F160振荡培养箱:哈尔滨市东联电子技术开发有限公司;电子天平:北京赛多利斯科学仪器有限公司;80-2B型台式低速离心机:湖南星科科学仪器有限公司;722E型可见分光光度计:上海光谱仪器有限公司;SY-2-4电热式恒温水浴锅:天津欧诺仪器仪表有限公司。 1.3 实验方法 1.3.1 离心20min 取出发酵液于80目的网筛过滤去菌丝, 之后将滤液在4 000 r/min下离心20 min;取1.0 m L滤液于100.0 m L容量瓶中, 用磷酸缓冲溶液定容至100.0 m L, 即制得稀释酶液。 1.3.2 中立酶活性测定 按照国家标准 (GB/T23527-2009) , 采用Folin-酚法测定中性蛋白酶活力。 1.3.3 培养时间和发酵培养基初始ph值确定 (1) 培养温度对毛霉发酵产中性蛋白酶酶活力的影响以10%的蔗糖、3%的黄豆粉、0.35%KH2PO4和0.1%Ca Cl2(五通桥毛霉为蔗糖8%、0.4%KH2PO4、0.08%Ca Cl2) 配制发酵培养基, 每500 m L三角瓶装液量150 m L, 调节p H 6.0, 0.1 Mpa、121℃灭菌30 min。冷却后接入孢子数为×106、2%的毛霉孢子悬液, 分别置于26℃、28℃、30℃、32℃、34℃下培养60 h, 充分发酵后制成粗酶液, 然后测定毛霉产中性蛋白酶酶活力, 确定最佳培养温度。 (2) 培养时间对毛霉发酵产中性蛋白酶酶活力的影响将发酵培养基在相同条件下灭菌、冷却后接入孢子数为×106、2%的毛霉孢子悬液, 分别置于30℃ (五通桥毛霉为26℃) 下, 培养36 h、48 h、60 h、72 h、84 h、96 h、108 h, 充分发酵后制成粗酶液, 然后测毛霉产中性蛋白酶酶活力, 确定最佳培养时间。 (3) 接种量对毛霉发酵产中性蛋白酶酶活力的影响将接种量为6%、8%、10%、12%、14%、16%的毛霉发酵培养基, 调节p H为6.5, 灭菌冷却后, 分别置于30℃下 (五通桥毛霉为26℃) , 培养72 h, 充分发酵后制成粗酶液, 然后测毛霉产中性蛋白酶酶活力, 确定最适接种量。 (4) 发酵培养基初始p H值对毛霉发酵产中性蛋白酶酶活力的影响调节毛霉发酵培养基初始p H分别为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0, 灭菌冷却后, 接入10%的毛霉孢子悬液 (五通桥毛霉为8%) 分别置于30℃下 (五通桥毛霉为26℃) , 培养72 h, 充分发酵后制成粗酶液, 然后测毛霉产中性蛋白酶酶活力, 确定最适发酵培养基初始p H。 (5) 装液量对毛霉发酵产中性蛋白酶酶活力的影响向500 m L的三角瓶中分别装入75 m L、100 m L、150 m L、175 m L、200 m L的发酵培养基, 调节p H为6.5, 灭菌冷却后, 接入10%的毛霉孢子悬液 (五通桥毛霉为8%) , 分别置于30℃下 (五通桥毛霉为26℃) , 培养72 h, 充分发酵后制成粗酶液, 然后测毛霉产中性蛋白酶酶活力