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放射毛霉胞外蛋白酶特性研究 腐腐乳，又称乳腐、乳豆腐、霉菌豆腐、鲜豆腐、豆腐或长毛豆腐，在中国烹饪。它是在豆腐生产的基础上发展起来的。它的生产起源于魏晋，在明清时期占主导地位。这是中国人民在豆腐生产方面的又一发明。腐乳的营养价值很高，除了含有大量的水解蛋白质、丰富的游离氨基酸和游离脂肪酸以外，还含有相当多的维生素B12，核黄素的含量比豆腐高6～7倍，还含有丰富的钙、磷、铁、锌等矿物质，且不含有胆固醇，具有质构细腻柔滑、滋味鲜美、诱人食欲的特点，是人们喜爱的开胃佐餐食品和调味品，在众多的豆制品中占有十分重要的位置，在欧美，因其质构类似软干酪而被称为中国干酪（Chinese-cheese）。 雅致放射毛霉（Actinomucor elegans 3.27），异名匍匐放射毛霉，是我国传统腐乳酿造中常用的菌种之一。腐乳生产中，前期培菌时毛霉分泌出以蛋白酶为主的酶系，后期发酵时该酶系连同辅料中的化学物质和酶协同作用，使腐乳成熟，其实质为生化酶学过程。多年来，人们在菌种选育、多菌种混合发酵上做了大量的研究，试图改进腐乳的生产工艺、缩短生产周期。然而，由于缺乏对腐乳酿造中参与酶系特性的研究，尤其是蛋白酶特性的研究，人们无法明了腐乳后酵的生化过程，使得腐乳的生产工艺和品质难以有较大的改进，生产周期长一直是无法克服的弊病。在此背景下，本文结合生产实际，对雅致放射毛霉胞外蛋白酶的酶学特性进行了研究，旨在为简化生产工序、缩短生产周期，为腐乳生产工艺的实质性改进提供理论依据。 1 材料和方法 1.1 病毒 雅致放射毛霉：北京王致和腐乳厂提供。 1.2 方法 1.2.1 粗酶液的提取 腐乳毛坯的制作： 酶液的提取：取毛坯，从坯体上剥离出菌丝，加入10倍于菌丝重的0.15mol/L的NaCl溶液，于4℃冰箱中过夜提取，6000r/min下冷冻离心10min，得粗酶液，稀释成适当浓度的待测酶液。 1.2.2 g酪氨酸水解 采用QB-1893紫外分光光度法。 蛋白酶活力定义：1mL酶液在37℃、1min水解酪素产生1μg酪氨酸为一个酶活力单位，以U/mL表示。反应混合液由2.00mL酶液和2.00mL酪素组成，在37℃水浴中水解一定时间后用4.00mL三氯乙酸终止反应，在275nm处测定吸光度。空白中先加入4.00mL三氯乙酸终止反应。 2 结果与分析 2.1 复合酶系统分析 保持一定的酶液浓度，用0.5mol/L的HCl和NaOH调节至不同的pH，测定酶活，结果如图1所示。 酶分子上有许多酸性、碱性氨基酸的侧链基团，随pH的变化处于不同的解离状态，从而直接影响酶与底物的结合，或影响酶空间结构以影响酶的活性。根据作用的最适pH，蛋白酶可以分为酸性、中性和碱性蛋白酶。图1显示，雅致放射毛霉胞外蛋白酶的作用范围较宽，在酸性环境中表现出较高活力，在中性和碱性环境中酶活力表现稳定。因此，该胞外蛋白酶应是以酸性蛋白酶为主、兼含中性和碱性蛋白酶组成的复合酶系。由于腐乳后酵过程中的酸度近于中性，所以起主要作用的蛋白酶是活力表现不高的中性蛋白酶。红方腐乳生产中，辅料中添加了红曲和面黄，其中含有丰富的蛋白酶，它们的加入对丰富酶体系、增加总体酶活力，从而促进蛋白质的水解和缩短生产周期起着重要的作用；青方腐乳的汤料中没有外来酶系的引入，因此后酵时间一般长于红方腐乳。 2.2 观点1.3检测中性处置前后织物上的残留酶活力 保持一定的酶液浓度，用0.5mol/L的HCl和Na OH调节至不同的p H，置于25℃水浴中保温1h，再调节至原始的p H，测定剩余的酶活，结果如图2所示。 图2显示，雅致放射毛霉胞外蛋白酶保温1h后的残存酶活在中性的环境中表现最高，随着酸度的增加或降低，残存酶活均迅速减少，说明该胞外蛋白酶系中，虽然酸性蛋白酶的活力较高，却很不稳定，保温后的酶活力远远低于中性蛋白酶活力。现行腐乳生产中，保温后酵（25℃）是加速腐乳熟化、缩短生产周期常采用的方法，中性蛋白酶活力在整个后酵过程中的变化是较平稳的，因此，中性蛋白酶在腐乳的后酵中发挥着重要的作用，下面对蛋白酶特性的研究也就以中性蛋白酶为主。 2.3 温度对质构的影响 将一定浓度的酶液分别置于25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃的水浴中保温1h，冷却至室温后，测定残存的酶活，结果如图3所示。 图3显示，雅致放射毛霉胞外蛋白酶在25℃～40℃之间的热稳定性良好；40℃以后，随着保温温度的增加，酶活力迅速降低；当保温温度达到60℃以上时，蛋白酶几乎全部失活。 2.4 温度对立地条件下2种外消化酶的影响 取一定浓度的酶液，分别测定其在25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃时的酶活力，结果如图4所示。 温度对酶促反应速度的影响有2方面：温度上升使底物能量增加，分