调肝治法方药对反复心理应激大鼠下丘脑和海马氨基酸含量的影响.docxVIP

调肝治法方药对反复心理应激大鼠下丘脑和海马氨基酸含量的影响 脑中的一些氨基酸作为神经传统的一个组成部分，在脑功能和心理行为中起着重要的调节作用。谷氨酸(Glutamic acid, Glu)和天冬氨酸(Aspartic acid, Asp)是哺乳动物中枢神经系统最重要的两种内源性兴奋性氨基酸。γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA)和牛磺氨酸(Taurine, Tau)均属于抑制性神经递质,尤其Tau是一个新近被确定的抑制性氨基酸,在脑内含量相对较高,常与GABA协同发挥抑制效应。本实验观察了反复心理应激反应大鼠下丘脑和海马Glu、Asp、GABA和Tau含量的变化,以及调肝、健脾、补肾治法方药和人参总皂甙的影响。 1 材料和方法 1.1 中药、成分配液及成汁配方 调肝方药组成及剂量:柴胡5g、白芍15g、枳壳6g、枸杞子15g、山栀5g、干地黄18g、石决明30g。肾气丸组成及剂量:干地黄30g、山药15g、山茱萸15g、泽泻10g、茯苓10g、丹皮10g,桂枝4g、附子4g。四君子汤组成以及剂量:党参20g、白术15g、茯苓15g、炙甘草6g。药材由本校第一附属医院药房提供,经药剂科鉴定均为纯正药材,常规煎煮取汁后调肝方药浓缩至含生药1.69g/ml,肾气丸浓缩至含生药1.76g/ml,四君子汤浓缩至含生药1.01g/ml(用药剂量为成年人70kg体重剂量的10倍)。高压灭菌,4℃冰箱保存备用。人参总皂甙由长春白求恩医科大学药剂科提供,配制成水溶液7mg/ml。调肝组、补肾组、健脾组及人参总皂甙组均于限制制动刺激前1h相应给予调肝方药、肾气丸煎剂、四君子汤煎剂及人参总皂甙溶液2ml灌胃,正常组及模型组以2ml生理盐水灌服。 1.2 饲养方式及分组 Wistar大鼠180~220g,雌雄各半,正常饮食,在光-暗周期为12h、温度20±2℃、安静环境下饲养7d。按体重随机分为6组:正常组,不施加任何刺激;模型组,给予制动刺激;调肝组,制动刺激前给予调肝方药;补肾组,制动刺激前给予肾气丸;健脾组,制动刺激前给予四君子汤;人参总皂甙组,制动刺激前给予人参总皂甙。 1.3 制动时间及限制制动次数 大鼠置自制的限制制动筒内(由大鼠固定仪改制而成),通过移动插片而逐步缩小大鼠的活动空间,调节到其不产生强烈反抗的紧张程度,每日限制制动1次,每日开始时间及限制制动时间不同,第1d为4h,其后每次增加30~60min,连续14d。造模大鼠在制动期间禁食、禁水。造模结束后在动物清醒、安静状态下进行实验。 1.4 测试指标和方法 1.4.1 超声波辅助提取氨基酸 称量大鼠体重,断头,迅速取全脑,于冰盘上分离下丘脑和海马,电子天平分别称重并记录。将各组下丘脑和海马分别置于玻璃浆器内,加入3ml甲醇,冰浴内充分匀浆,用毛细吸管将提取液转移至25ml离心管中,小心防止提取液损失,每次用2ml甲醇再提取二次,合并三次提取液,总计约7~8ml,摇匀,置超声波上处理30min,10000rpm冷冻离心30min,将上清液转入20ml小瓶中,置80℃水温上水浴至甲醇蒸发至干,在瓶内准确加入5.0ml/L HCl,置超声波处理30min,在超声波处理过程中,小心摇动小瓶,使氨基酸成分溶出,将溶出物转入10ml离心管中,10000rpm冷冻离心30min,取上清液,用于氨基酸分析。 1.4.2 荧光检测条件 HP-1050型高效液相色谱仪,配HP-1050型四元梯度泵、自动进样器,HP-1046A型荧光检测器和HPLC-2D色谱工作站。色谱柱:HP Hypersil ODS 5μm 125*4mm。流动相:A:8.0mmol/L磷酸盐缓冲溶液(pH=7.2),含0.3%四氢呋喃。流动相:B:8.0mmol/L磷酸盐缓冲溶液(pH=7.2)+甲醇+乙腈(50+35+15)。流量:1.0ml/min。柱前自动衍生程序:设置自动进样器程序为依次吸取1μl OPA试剂,5μl 0.1mol/L pH=10.4硼酸盐缓冲液和1μl样品,并设定每次吸取不同的溶液前用蒸馏水洗涤针头,然后在线混合5次,等待1.5min,进样。梯度洗脱程序:0min,0%B;25min,100%B;35min,100%B;35.1min,100%A;45min,100%A。然后开始下一个样品的分析。检测程序:荧光检测器波长:EX=340nm,EM=450nm。OPA柱前衍生反相高效液相色谱法。 2 结果 2.1 各组小鼠海马glu和体重 Glu和Asp含量变化下丘脑Glu和Asp:与正常对照组相比,模型组下丘脑Glu和Asp水平均无明显变化。补肾组下丘脑Glu与正常对照组相比无明显性差异(P0.05)。人参总皂甙组下丘脑Glu明显下降(P0.05)。调肝组与补肾组下丘脑