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白茎结构及内生真菌的研究 b.黑市。白芨为我国传统中药,以其干燥的块状假鳞茎入药,可用于咯血、吐血、外伤出血、疮疡肿毒和皮肤皴裂等,现代科学研究证实可以治疗肝癌以及血管瘤等病症,具有较高的药用价值。同时,白芨植株矮小健壮,花色为紫红色,且花形奇特,具有较高的观赏价值,因此市场需求不断增加。 目前野生白芨遭到无限制的采挖,同时,其自然生境也遭到严重破坏,已被《中国植物红皮书———稀有濒危植物》第1册收录,同时也被写入了1997年制定的《华盛顿公约》,即《濒危野生动植物国际贸易公约》(Convention on International Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora,CITES)保护种类。只有通过人工栽培,才能既满足市场需求,又保存目前已经十分稀少的野生白芨资源。白芨的人工栽培多以分株繁殖为主,很多科研工作者已进行了组织培养研究[5,6,7,8,9,10,11,12,13],但仍存在培养周期较长、生产成本高、且幼苗在炼苗及移栽后生长状况较差和成活率低等一系列实际问题,尚鲜见白芨组培苗规模化繁育的报道。因此,在白芨的实际生产和种植过程中,仍以块茎的分株繁殖这一无性繁殖方式为主,因此对白芨块茎进行研究对白芨人工栽培具有十分重要的意义。白芨块茎在国外文献一般记录为假鳞茎(pseudobulb),在中国植物志中也记录为假鳞茎,但因国内大部分文献记录为块茎,该文亦采用块茎一词。白芨地下有菌根和块茎两种结构,均与白芨的繁殖和生长发育有关,此前已经对白芨的菌根进行了研究,观察及实验表明白芨形成菌根,并分离出了多种真菌。块茎生长于地下,是白芨的药用部位,又可用于营养繁殖,其结构如何,是否会受到真菌的侵染,均与白芨的人工栽培密切相关。因此该研究拟对白芨的块茎进行切片观察,揭示其显微结构,同时进行真菌分离实验,以确定白芨块茎内是否有真菌感染。在此基础上,探讨了白芨块茎的结构和功能的相互适应性,以便为白芨的栽培提供一些借鉴。 1 材料和方法 1.1 野外采集及土壤样品采集 供试材料野生白芨分别采自云南省5个县市(玉溪市江川县李家山、昆明市郊区长虫山、楚雄市苍岭镇谢柳屯后山、楚雄州元谋县羊街以及大理州巍山县巍宝山),野外采集后连同原生地土壤带回温室栽培。试验时材料取自温室栽培的白芨。 1.2 方法 1.2.1 白多糖的检测 取出白芨块茎,在流水下冲洗干净,切成约0.4cm×0.8cm,厚约0.3cm的小块,固定于FAA固定液48h以上。材料固定后,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,常规石蜡制片(切片厚度10μm),番红固绿对染,加拿大树胶封片,用OLYMPUS BX-51观察,cellSens[Vers.1.4]显微数码成像系统拍照。 同时,还进行块茎中白芨多糖的组织化学定位实验,采用高碘酸-Schiff反应(PAS反应)检验多糖的含量和贮藏部位。按照常规石蜡切片法制片,切片脱蜡至蒸馏水步骤,流水冲洗10～15min,然后用0.5%高碘酸处理15min左右,蒸馏水洗涤,再用Schiff试剂处理30min,漂洗液漂洗3次,常规石蜡切片法制片,乙醇梯度脱水,固绿对染,二甲苯透明,加拿大树胶封片,用O-LYMPUS BX-51观察,cellSens[Vers.1.4]显微数码成像系统拍照。 1.2.2 表面消毒的制备 真菌分离实验用PDA培养基:去皮马铃薯200g(沸水煮30min后4层纱布过滤取其滤液),葡萄糖20g,琼脂15～20g,水加至1 000mL,自然pH。121℃灭菌25min。每升培养基中加100μg·mL-1的硫酸链霉素和青霉素G钠以抑制细菌生长,倒平板备用。 取生长健壮的白芨块茎,冲洗去除表面附着物质,用沾有肥皂粉的毛刷清洗表面,流水冲洗30min后晾干,然后依次用灭菌水冲洗1次,75%的酒精溶液消毒30s,灭菌水冲洗1次,0.1%汞处理10min,灭菌水清洗5次,取最后一次清洗后的洗液作为对照组,以检查表面消毒是否彻底。然后把消毒好的块茎切成0.5cm×0.5cm,厚度为0.2cm左右的小块,将切好的块茎水平放置PDA平板上,每皿5个小块,于28℃保温箱中倒置培养7d。 2 结果与分析 2.1 白茎的基本组织 白芨的块茎具有单子叶植物类型的茎结构特征,具一层厚的表皮细胞,无气孔(见图版1中的2),表皮内有下皮层(见图版1中的2),下皮层内为薄壁组织构成的基本组织,多数小型维管束星散分布于薄壁组织中(见图版1中的3)。 白芨块茎的表皮细胞为长方形,细胞壁显著加厚,外被极为发达的角质层(见图版1中的2),表皮细胞间排列紧密,表面观为不规则型细胞紧密镶嵌而成,没有气孔分布于表皮细胞间,亦没有任何表皮毛(见图版1中的1,2)。紧贴表皮的一层细胞,细胞壁也有一定程度的加厚而没有内