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响应面法优化连钱草总黄酮提取工艺 连草是属于嘴唇科的血毒症[glechomalanituba（nakai）kubar.]干燥的土壤部分。连钱草性味凉辛, 微苦, 微寒。归肝、肾、膀胱经, 具有利胆、利尿、抗菌、抗炎、降血糖、抗肿瘤以及抗腹泻等药理作用, 主治黄疸型肝炎、胆囊炎、胆石症、疳积、肾结石、膀胱结石、多发性脓疡、疮痈肿痛、婴儿湿疹、跌打损伤、腮腺炎、牙痛等症。 连钱草的主要化学成分有萜类、黄酮、挥发油、有机酸以及多糖等。其中, 萜类化合物主要包括熊果酸、齐墩果酸、乌苏酸、2-羟基乌苏酸等;黄酮和黄酮苷类化合物包括木犀草素、芦丁、芹菜素、刺槐素、海常素、胡萝卜苷、槲皮素、连钱草酮等;挥发油类化合物包括左旋薄荷酮、胡薄荷酮、旅烯、柠檬烯、1, 8-桉叶素、异薄荷酮、异松樟酮、α-松油醇等, 具有特殊的清香味;有机酸类化合物包括阿魏酸、咖啡酸、介子酸、月桂酸、迷迭香酸、原儿茶醛、迷迭香酸甲酯、三十烷酸、肉豆蔻酸等有机酸。 目前针对连钱草总黄酮提取工艺的研究尚不多见。本研究通过考察提取时间、提取温度、液固比和乙醇等因素, 采用单因素试验和Box-Behnken试验优化了连钱草总黄酮的提取工艺, 结果理想, 报告如下。 1 仪器和试剂盒 1.1 主要仪器和设备 TU-1810型紫外可见分光光度计 (北京普析通用仪器有限责任公司) 、RT-02A型多功能粉碎机 (弘荃机械企业有限公司) 、BECKMAN COUCTER型离心机 (美国BECKMAN公司) 、HHS型恒温水浴锅等仪器 (上海博讯实业有限公司医疗设备厂) 。 1.2 植物活检丹glechomalus 连钱草由南京同仁堂洪泽中药材科技有限公司提供 (经姜宁副教授鉴定为唇形科活血丹属植物活血丹[Glechoma longituba (Nakai) Kupr.]) , 烘干, 粉碎, 过60目筛;无水乙醇、芦丁、亚硝酸钠、硝酸铝等均为分析纯, 购自国药集团化学试剂有限公司。 2 方法和结果 2.1 黄酮含量测定 2.2 bohsk试验 2.2.1 c.11d回归模型 在预试验基础上, 采用Design-Expert 8.0的Box-Behnken设计, 以提取时间、温度、液固比、乙醇浓度为自变量, 黄酮提取率为响应值。试验因素水平设计和结果分别见表1、表2。 根据试验结果, 建立了如下回归模型:R=6.38–0.16A+0.057B+0.44C+0.11D+0.15AB+0.11AC+0.62AD+0.36BC+0.030BD+0.013CD-0.63A2–0.61B2–0.85C2–0.54D2。该回归模型的决定系数R2为0.9746, 校正后的决定系数 (adj-R2) 为0.9493, 说明该模型拟合性较好。对回归模型和各因子进行方差分析, 结果见表3。从表3可知:该模型F值为38.41, P值0.0001, 而失拟性试验F值为2.19, 不显著, 说明此模型与实际情况拟合得较好。根据F值和P值, 可以得出各因素对响应值的作用由大到小为:C2A2B2CD2ADBCADABACBBDCD。其中:B、AB、AC、BD、CD对响应值的作用不显著, 所以上述回归方程中以上几项可以忽略, 所得回归方程如下:R=6.38–0.16A+0.44C+0.11D+0.62AD+0.36BC-0.63A2–0.61B2–0.85C2–0.54D2。 2.2.2 黄酮提取率的确定 由Box-Behnken试验结果所得的回归方程, 可以计算出当A=-0.05, B=0.13, C=0.28, D=0.08时, R有极大值6.45%。将各因素的水平回代, 可以得到最优工艺是提取时间1.4975h, 41.3℃, 液固比22.8∶1, 乙醇浓度90.4%时, 黄酮提取率最高。为了操作方便, 将优化的工艺确定为提取时间1.5h, 提取温度41℃, 液固比23∶1, 乙醇浓度90%, 并对该工艺进行了验证, 连钱草黄酮提取率在6.32%~6.47%之间。说明经过响应面法优化的工艺具有很强的实践指导作用。 2.2.3 不同a和c和d对黄酮提取率的影响 图1为响应面分析。从中可以看出:当C=0.28, D=0.08时, 黄酮的提取率随着A和B的增加而上升, 当达到最大值后, A和B的上升反而会使提取率下降 (图1A) ;B和D分别为0.13、0.08时, A和C处于低水平时, 响应值较低, 随着A和C的升高, 响应值也随之升高, 当到一定程度后, 响应值不再随A和C的上升而上升, 而是下降 (图1B) ;如B=0.13、C=0.28, A和D的变化会显著影响黄酮的提取率, 当A和D较小时, 黄酮提取率也较低, 当A和D增大后, 提取率也增高, 当提取率达到极大值后, 其会随着A和D的上升而下降 (图1