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聚酰胺颗粒分离纯化土茯苓总黄酮工艺研究 土耳其语是百合科广叶谷的干燥根系，具有除湿、解毒、关节和其他功能。土茯苓中含有多种二氢黄酮类衍生物,如落新妇苷(astilbin)、异落新妇苷(isoastilbin)等。近年来药理、临床实验证明土茯苓具有抗癌、抗动脉硬化等作用,主要有效成分落新妇苷具有较强的抗炎、镇痛、利尿作用。笔者未见国内用聚酰胺吸附处理、纯化土茯苓总黄酮的报道。本研究采用聚酰胺颗粒分离纯化土茯苓总黄酮,通过考察不同条件下聚酰胺颗粒对土茯苓总黄酮的静态和动态吸附与解吸特性,优选出最佳的纯化工艺。 1 药品、化学品和聚酰胺颗粒 Agilent 1100高效液相色谱仪,Kromasil C-18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);普析通用TU-1901紫外可见分光光度计;德国BP211D Sartorius电子天平(十万分之一);落新妇苷对照品:广州医药工业研究所曾祥腾老师提供;黄杞苷对照品:广东食品药品职业学院颜仁梁老师提供;芦丁对照品:购自中国药品生物制品检定所,批号:100080-200306。聚酰胺颗粒(14～30目):浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂生产;乙腈(色谱纯,SIGMA公司)。水为重蒸水,其它实验所用试剂均为分析纯。土茯苓药材购于佛山市南海鹏扬药业有限公司,经广东食品药品职业学院中药与生物系颜仁梁老师鉴定为百合科光叶菝葜(Smilax glabraRoxb.)的干燥根茎。 2 方法 2.1 重量测定 2.1.1 标准品溶液的制备 采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法,以芦丁为对照品,试样中加入铝离子试剂,同时控制适宜的pH值,使黄酮类物质与铝离子形成络合物,在可见光区获得稳定的特征吸收峰,进行比色法测定。标准曲线的绘制:取经105 ℃干燥至恒重的芦丁对照品适量,精密称重为5.99 mg,置25 mL量瓶,加70%乙醇溶解并稀释至刻度,摇匀,得浓度为0.2396 mg/mL的标准溶液。精密吸取该标准溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL分别置25 mL量瓶中,各加70%乙醇至6.0 mL,加5%NaNO2溶液1.0 mL,摇匀,放置6 min,加入10%Al(NO3)3溶液1.0 mL,摇匀,放置6 min,加NaOH试液10.0 mL,加70%乙醇至刻度,混匀,放置15 min,以1号量瓶溶液为空白,于505 nm处测定吸光度值,以芦丁量(mg)为横坐标,以吸光度值为纵坐标,绘制标准曲线,回归方程为Y=0.4572X-0.0173,r=0.9996(n=6),芦丁在0.2396～1.4376 mg范围内具有良好的线性关系。 2.1.2 线性关系的考察 色谱条件:Kromasil C-18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相:磷酸水溶液(pH=3)-乙腈(80∶20);柱温:30 ℃;流速:1.0 mL/min;检测波长:290 nm,理论塔板数以落新妇苷峰计不低于8 000。标准曲线的绘制:对照品溶液:称取落新妇苷、黄杞苷对照品适量,精密称定,加60%乙醇溶解,分别制成每1 mL含233 μg的落新妇苷对照品储备溶液和每1 mL含50.24 μg的黄杞苷对照品储备溶液。精密吸取落新妇苷对照品储备溶液1、2、3、4、5、6、7、8 mL及黄杞苷对照品储备溶液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4、2.8、3.2 mL,置10 mL量瓶中,加60%乙醇稀释至刻度,制成系列混合对照品溶液,精密吸取上述混合对照品溶液各10 μL,注入液相色谱仪,分别记录峰面积,以峰面积为纵坐标,对照品进样量(μg)为横坐标,进行线性回归,回归方程为:落新妇苷Y=2343.7X-9.8517,r2=0.9999(n=8);黄杞苷Y=2014X+9.975,r2=0.9999(n=7,1号溶液未检出黄杞苷峰),结果表明落新妇苷在0.233～1.864 μg、黄杞苷在0.0402～0.1608 μg范围内呈良好的线性关系。精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL,注入液相色谱仪,测定,以外标法计算,即得样品溶液中落新妇苷、黄杞苷的含量。 2.2 无醇味剂和醋酸 参考有关文献,取聚酰胺颗粒用95%乙醇浸泡48 h,水洗至无醇味,用1%NaOH浸泡24 h,水洗至中性,10%醋酸浸泡24 h,水洗至中性,减压干燥备用。 2.3 总黄酮浓度的测定 取土茯苓饮片150 g,粉碎,60%乙醇回流提取3次,滤过,合并滤液,回收乙醇至无醇味,加热水稀释,离心,取上清液定容至1 000 mL(6.7 mL/g生药),即得,总黄酮浓度为10.52 mg/mL。 2.4 总黄酮浓度的测定 取经预处理的聚酰胺颗粒适量,精密称重,置具塞三角瓶中,加入土茯苓总黄酮浓缩液,充分震荡,过滤,