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天然香兰素的生产方法 香兰素（4-羟色胺-3-甲基苯基磺酸）主要存在于天然植物的香珠兰中，是世界上最重要的香料之一。香兰素独特的无法用人工方法复合而成的香气,使得她在许多领域得到广泛应用。香兰素大部分应用于食品工业中,是高档食品不可缺少的调香原料,在香精香料、饮料和医药工业中也发挥重要作用,全球每年的需求量超过16 000 t。市场上供应的香兰素有两种——合成香兰素和天然香兰素。化学法合成的香兰素,供大于求,市场价格较低,每公斤不到15美元,这种香兰素不仅香型单一,而且合成过程中污染严重而无法被人们接受。天然香兰素主要是从天然香荚兰中提取,但是香荚兰种植区域有限,产量受气候影响大,劳动强度大,得到的天然香兰素价格极其昂贵,每公斤售价高达4 000美元,约为合成香兰素的300倍。目前最具潜力的生物合成法具有原料天然且廉价易得,生产过程清洁无污染,快速高效等优点,利用生物技术手段(微生物转化法)生产天然香兰素已成为一种值得推广的新渠道。但是如何达到工业化生产需要的高产量,并且使下游的产物分离纯化过程简单化、经济化,实现更高的经济效益,仍是天然香兰素价格居高不下的主要限制因素,这也是现阶段科学研究领域的瓶颈,亟待突破性的创新研究。 1 香兰素生产方法的比较 1.1 碱土木质素磺酸盐法 据统计,现今市场上绝大部分(约90%)的香兰素产品是利用化学合成法生产的,供大于求,其原料主要是木质素和愈创木酚。 以木质素为原料:木质素来源广泛,纸浆废液中含量也极其丰富,其主要以木质素磺酸盐的形式存在。以其为原料,在碱性条件下水解再经氧化可得到香兰素,如图1所示。该方法具有原料丰富、工艺简单、操作方便等优点,收率为10%-15%左右。 以愈创木酚为原料,Riedel反应法:愈创木酚首先与乙醛酸缩合生成3-甲氧基-4-羟基扁桃酸钠,再经氧化、酸化生成香兰素,如图2所示。 1.2 香荚兰深加工产品 香兰素以游离态和葡萄糖苷的形式广泛存在于自然界植物中,尤其在香荚兰豆中,含量约为20 g/kg(干重)。世界香荚兰产地目前主要集中在马达加斯加、印度尼西亚、科摩罗、留旺尼、乌干达、墨西哥和塔希提等岛屿国或地区。香荚兰的深加工产品主要是香荚兰浸剂,方法是先将香荚兰切碎放入浸提器中,用95%的乙醇在50oC-60oC条件下浸提,过滤后即可。这种方法成本高、费时,且溶剂会残留。采用超临界溶剂萃取技术,无毒、无溶剂残留、在加工过程中也不接触空气,因此香兰素不会发生水解、氧化和酯化等反应,收率也较高。 1.3 香兰素的生产 植物细胞培养法:1991年Knuth等提出,香草愈伤组织细胞悬浮培养物会分泌出一种复杂的带香荚兰香味的物质,在不加前体物的条件下用活性炭连续提取14 d后,可以得到0.099 g/L香兰素。另有研究者尝试利用组织培养香荚兰(Vanilla)和辣椒(Capsicum)来生产香兰素,产量都非常低,离工业化应用还有很大的距离。 酶法转化:酶促反应具有高效、专一,反应条件温和,能耗低,污染小等优点。在香兰素的生产中,也有酶法合成的报道。van den Heuvel等发现利用香草醇氧化酶(Vanillyl-alcoh oloxidase,VAO)可以生产香兰素,底物木焦油醇在VAO的催化下经香草醇氧化合成香兰素。 以天然原料为底物的微生物转化法:鉴于香兰素广泛应用于食品工业中,其是否天然、健康备受消费者的关注。以天然原料为底物,利用生物技术,经微生物转化生产的香兰素经欧洲和美国的食品法规认可为天然的香兰素。经过数十年的研究,迄今已报道的利用微生物转化法生产天然香兰素的最高产量达到19.2 g/L。 综合比较上述3种香兰素生产方法,化学合成法生产的香兰素香型单一,在生产过程中易掺杂影响香兰素的香味和色泽,污染也非常严重由此得到的香兰素被认为“非天然”。从植物香荚兰中提取的香兰素是天然的,但由于香荚兰的种植区域有限,产量受气候影响大,作物种植及加工处理劳动强度太大,生产的天然香兰素远不能满足市场的需求。而且,在组织培养中香荚兰生长非常缓慢,因此香荚兰对于大规模的香兰素生产并不理想。生物合成途径具有原料廉价易得反应条件温和,节约能源,反应专一性高,产物易分离提取等优点。微生物,鉴于其生长快速和容易进行分子遗传学改造等优点,是生产香兰素的理想选择。中国是香兰素的出口大国,“十五”期间就开始研究微生物转化法生产香兰素,并且取得了较好的成果。2004年周庆礼等研究发现链霉菌L1936不仅能耐受高浓度的香兰素,而且具有一种与其他菌株完全不同的代谢流,其在转化底物阿魏酸的过程中,当香草酸的积累量达到200 mg/L时,就开始积累香兰素作为代谢流的主要产物;他们通过流加2次底物使之浓度达到13 g/L,最终产物香兰素浓度达到7.12 g/L,相应的摩尔转化率为69.9%。2