宏基因组技术在微生物中的应用.pdfVIP

宏宏基基因因组组技技术术在在 微微生生物物中中的的应应用用 蒋超 4031031182 ·1.宏基因组概述 ·2.环境宏基因组学基本技术 ·3.环境宏基因组学技术的主要瓶颈 11..宏宏基基因因组组概概述述 1.1.微生物资源开发应用的新途径 · 据估计每克土壤样品 可含有高达4,000种的不同微生物， 77 1g土壤就包含6.1×10个基因。 · 传统途径—培养途径 开发环境微生物基因资源较为传统的研究途径是:分离微生物, 获得纯培养,基因表达产物活性检测、活性物质的分离纯化直 至开发利用。这一途径被证明是十分有效的,也获得了诸多有 应用价值的活性物质。但是,环境 仅有0.1%~1%的微生物 能够采用现有培养技术进行分离培养,在今天采用传统培养方 法已很难发现新的活性物质,极大地限制了未培养微生物基因 资源的开发利用。 ·新途径—宏基因组途径 近年来发展起来的宏基因组克隆技术,直接提 取环境样品核 进行遗传操作,避开了微生物 分离培养问题,极大地扩展了微生物资源的利 用空间。已在土壤生态环境、海洋生态环境 和各种极端环境中开展应用。 1.2.宏基因组定义 · “1998年Handelsman等首次提出宏基因组 的概念。 种以环境样品中的微生物群体基 因组为研究对象,以功能基因筛选和测序分析 为研究手段,以微生物多样性、种群结构、进 化关系、功能活性、相互协作关系、及与环 境之间的关系为研究目的的新的微生物研究 方法。 ·宏基因组文库既包括了可培养的,又包括了未培养的 微生物遗传信息,因此增加了获得 生物活性物质的 机会。 ·采用构建宏基因组文库的策略筛选 的基因资源及 其表达活性产物的一般流程可以归纳为:样品和基因 (组)的富集;提取特定环境中的基因组DNA或mRNA ; 构建宏基因组DNA或cDNA文库;筛选 目的基因;目的 基因活性产物表达。 图2 2.环境宏基因组学基本技术 ·环境宏基因组学研究的基本思路是直接提取环境中 所有微生物的基因组DN ,克隆到合适的载体,通过 构建宏基因组文库,将环境中全部微生物的核酸信息 收集在一起,运用序列筛选或功能筛选方式从文库中 获得有用的酶、抗生素等生物活性物质及相关基因。 ·其前端关键性技术是环境DN (environmental DN ,eDN )的提取,eDN 提取方法的精确程度将直 接决定文库中微生物信息的精确度;下游关键性技术 是文库的分析与筛选技术。 2.1环境样品及目的基因组富集 ·在宏基因组文库筛选过程中目的基因仅占总 DNA的 小部分,对环境样品的预富集可以大 大提高目的基因的检出几率。目前预富集技 术主要分为细胞水平富集和基因组水平富集。 ·细胞水平富集主要是通过利用选择培养基对 目的微生物进行富集培养,最常用的 法是底 物选择,此外还包括营养选择及物理化学指标 选择。但是由于富集培养选择性地富集了具 有快速生长特性的菌群,因此导致大部分物种 多样性信息丢失。目前可以通过先在严格胁 迫条件下短期处理,然后改为较温和的处理条 件,可以从一定程度上克服这种 法的局限性。 ·基因组水平富集常用的技术为稳定同位素探针技术 (SIP),原理是 用稳定同位素标记底物,其中的 “重” 原子掺入到具有代谢活性的微生物核酸中, 用密度 梯度离心的方法将 “重”的DNA与 “轻”组分分离, 被标记的 “重”核酸可以作为PCR的模板,用来构建 宏基因组文库。此外,还有报道利用抑制性消减杂交