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3种拮抗菌制剂对西瓜枯萎病的拮抗作用 西瓜萎缩是西医最重要的疾病之一。近年,由于西瓜种植面积不断扩大,造成轮作困难,致使枯萎病的为害也逐年加重。重茬地一般发病率在30%左右,严重地高达80%以上,甚至绝产。目前,化学防治仍是控制西瓜枯萎病的主要措施,但由于长期大面积连续使用,防效已日渐降低。利用拮抗菌防治西瓜枯萎病越来越受到重视,国内已进行了用非致病镰刀菌、荧光假单胞菌、绿色木霉以及哈茨木霉等防治该病害的试验,但尚无联合利用拮抗真菌和拮抗细菌防治西瓜枯萎病的报道。本文对绿色木霉TR-8和芽孢杆菌B67联合防治西瓜枯萎病进行了初步研究。 1 材料和方法 1.1 微生物可湿性制剂 西瓜枯萎病菌由沈阳农业大学生物农药工程中心分离;50%多菌灵可湿性粉剂,江苏省新沂农药厂生产;0.5%施特灵水剂,河北省南宫生物化工厂生产;西瓜品种为郑杂九号,合肥丰乐种业股份有限公司繁育。 1.2 生长抑制率测定 在辽宁省各地采集健康西瓜或黄瓜的根际土壤及幼根,分别采用土壤稀释法和根组织分离法,于PDA、NA和选择性培养基cPCAT上进行分离。分离得到的木霉菌和细菌经反复纯化,转移到斜面(PDA或NA)上,4℃下保存。将木霉菌和西瓜枯萎病菌扩繁,打取直径6mm的菌饼,PDA平板上于25℃下对峙培养5d后,测量菌落半径,计算病原菌生长抑制率。 用接种环取一环分离得到的细菌,在PDA平板中间划一直线,于直线两侧相距2cm处分别接一直径为6mm的西瓜枯萎病菌菌饼,以只接病原菌者作对照,于27℃下培养3d后,测量病原菌向细菌方向生长的距离,以R值表示拮抗作用的大小。 1.3 tr-8、s1e-7e-7e-d的配制 将拮抗木霉和拮抗细菌在各自特定发酵培养基内恒温振荡培养7d后,取发酵物与营养载体混合,分别配制成108cfu/g的TR-8制剂、1010cfu/g的B67制剂和109cfu/g的健根宝粉剂(TR-8∶B67=1∶1)。 1.4 西瓜幼苗期枯涣病 西瓜枯萎病菌用玉米砂培养基于25℃培养10d后,与灭菌细土等比例混合制成菌砂土。取老菜田土,过筛灭菌后,以药∶土=1∶60的比例拌入TR-8制剂、B67制剂、健根宝粉剂和多菌灵可湿性粉剂,装入分苗营养钵中。每钵均匀拌入菌砂土3g,并移栽健康西瓜(1片真叶)幼苗1株,正常栽培管理。每处理30株,重复4次,以不拌药者作对照。25d后取出西瓜苗,调查发病情况,计算病情指数和病指防效。西瓜幼苗期枯萎病分级标准:0级为茎内维管束正常,外部无症状;1级为茎内维管束1/4以下变色;3级为茎内维管束1/4～1/2变色;5级为茎内维管束1/2～3/4变色;7级为茎内维管束3/4以上变色,部分叶片萎蔫;9级为整株枯死。 1.5 条田块、田块设置 田间试验分别在沈阳市新城子区道义镇和新民市柳河沟镇进行。在道义镇选择连续三年种植西瓜的田块,设健根宝1∶50、1∶60和1∶70拌过筛细土3个处理,以多菌灵1∶50拌过筛细土作药剂对照,以不拌药过筛细土作空白对照。将药土均匀撒在播种穴内之后播种,每穴撒药土100g。每处理15m2,重复3次。播种55d后调查发病情况,计算相对防效。在柳河沟镇,选择连续两年种植西瓜的田块,设健根宝400倍、500倍和600倍液灌根3个处理,以施特灵500倍液灌根作药剂对照,以清水作空白对照。分别于5月20日和6月2日灌根,每株200ml。每处理20m2,重复3次。6月20日调查发病情况,计算相对防效。 2 结果与分析 2.1 细菌分离结果 从分离的菌株中,共筛选出对西瓜枯萎病菌具有较强拮抗作用的木霉菌9株、细菌10株。拮抗作用测定表明,TR-8菌株对西瓜枯萎病菌的抑制作用最强;其次是TR-3菌株,培养5d后的生长抑制率分别达到39.47%和31.59%(表1)。经鉴定,TR-8菌株属绿色木霉(Trichoderma viride)。TR-8生长速度极快,气生菌丝茂盛,产孢量大。当将TR-8和西瓜枯萎病菌在同样条件下分别纯培养时,TR-8的生长速度略快于西瓜枯萎病菌;但当将两者对峙培养时,TR-8生长速度基本正常,而西瓜枯萎病菌却明显受到抑制。在TR-8与西瓜枯萎病菌的菌丝交接处,后者菌丝变黄并停止生长。随着TR-8的扩展,逐渐将西瓜枯萎病菌覆盖,并产生大量木霉菌分生孢子。被全部覆盖后,西瓜枯萎病菌停止生长,并渐渐干枯死亡。在分离筛选的细菌中,B67和B71菌株对西瓜枯萎病菌抑菌效果最明显。对峙培养3d后R值分别为0.2222和0.3333(表2)。B67菌株繁殖生长速度最快,接种几小时即可形成明显菌落。经初步鉴定,B67属芽孢杆菌(Bacillussp.)。观察发现,西瓜枯萎病菌向拮抗细菌生长一定距离后停止生长,两者之间形成明显的拮抗带。 2.2 根宝粉的病指防效 室内人工接菌防治试验结果(表3)表明,T