药学微生物（第三版） 课件 1-1-3 实训 细菌染色技术.pptx

实训 细菌染色技术 （一）实训目的 1.了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。2.熟悉细菌涂片、染色的基本技术。3.掌握细菌的简单染色与革兰氏染色法，并进一步掌握油镜的使用方法。 （二）实训原理 染色法 单染色：仅用一种染料着色； 复染色：用两种或两种以上的 染料着色。复染色法中较为常用的是革兰氏染色。 革兰氏染色法是将细菌制成标本后，用结晶紫(或龙胆紫)初染，再加碘液媒染，将各种细菌均染成深紫色。然后用95％的乙醇脱色，其中有的细菌脱去紫色，有的细菌仍保持紫色。最后用复红(或沙黄)液复染。 通过染色可将细菌分成两大类：一类不被乙醇脱色而保持紫色者，为革兰阳性菌，用G+表示；另一类被乙醇脱去紫色后复染成红色者，为革兰阴性菌，用G-表示。 革兰氏染色法的原理：①G+菌等电点(pH2～3)比G-菌等电点(pH4～5)低，在同一pH条件下G+菌比G-菌所带负电荷多，因此与带正电荷的碱性染料结合力强，不易脱色；②G+菌体内含有大量核糖核酸镁盐，可与进入体内的结晶紫、碘液等牢固结合成大分子复合物。G-菌含核糖核酸镁盐很少，故易被脱色；③G+菌细胞壁结构致密，肽聚糖层厚，含脂质少，乙醇不易渗入脱色；G-菌细胞壁结构疏松，肽聚糖层薄，含脂质多，乙醇容易溶解脂类而渗入使之脱色。 （三）材料和用具细菌：大肠杆菌和金黄色葡萄球菌18～24h培养物。试剂：香柏油、二甲苯、生理盐水、吕氏美蓝染色液、草酸铵结晶紫染色液、碘液、95%乙醇、稀释的石炭酸复红染色液。其他：显微镜、酒精灯、载玻片、接种环、擦镜纸、吸水纸、火柴等。 （四）操作步骤1．细菌的单染色法 1．细菌的单染色法 （1）涂片 取洁净无油渍的玻片一张，将接种环在酒精灯火焰上烧灼灭菌后，取1～2环无菌生理盐水，放于载玻片中央，再将接种环灭菌、冷却后，从固体培养基上取少许菌落或菌苔与生理盐水混匀，作成直径1cm的涂面（如液体培养物，可取一环直接涂于玻片上即可）。接种环用后在火焰上灭菌，杀死残留的细菌。 （2）干燥 涂片应在室温下自然干燥，必要时将涂面向上，置酒精灯火焰高处微烤加热烘干，但切忌直火加热，避免细菌变形。 （3）固定 固定的目的是杀死细菌，使菌体蛋白质凝固，形态固定，易于着色，并且经固定的菌体牢固粘附在玻片上，水洗时不易冲掉。常用的固定方法有火焰固定和化学固定两种。火焰固定 将干燥好的涂片涂面向上，在火焰上以钟摆的速度来回通过3～4次，以手背触及玻片微烫手为宜。化学固定 将干燥好的玻片浸入甲醇中固定2～3min后取出晾干，或在涂片上滴加甲醇使其作用2～3min后自然挥发干燥。 （4）染色：在已干燥、固定好的涂片上滴加适量的美蓝染色液或稀释复红染色液，使染液盖满菌面，染色约1～2min。（5）水洗：倾去染液，用细小的水流将染料洗去，至洗下的水没有颜色为止。注意不要使水流直接冲至涂面处。（6）干燥：在空气中自然干燥；或将标本压于两层吸水纸中间充分吸干，但不可磨擦；也可以在酒精灯火焰高处微烤加热干燥。（7）镜检：先在低倍镜下找到物像，并调至视野中间，然后滴加香柏油，置油镜下观察。 2．细菌的革兰氏染色法 （1）涂片①常规涂片法：取一洁净的载玻片，用特种笔在载玻片的左右两侧标上菌号，并在两端各滴一小滴蒸馏水，以无菌接种环分别挑取少量菌体涂片，干燥、固定。②“三区”涂片法：在玻片的左、右端各加一滴无菌水，在无菌操作环境下挑取少量金黄色葡萄球菌与大肠杆菌均匀涂于两滴水中，并将少量菌液都适应延伸至玻片的中央，使其形成含有两种菌的混合区，干燥、固定。 （2）初染。在干燥、固定好的涂片上滴加草酸铵结晶紫染色液，染色2～3min，水洗，同单染色。 （3）媒染 滴加碘液染1～2min。（4）水洗。同单染色。 （5）脱色。在95%乙醇脱色缸内脱色30 s或滴加95%乙醇2～3滴于涂片上，频频摇晃3～5s后，倾去酒精，再滴加酒精，如此反复2～5次，直至流下的酒精无色或稍呈浅紫色为止。脱色时间可根据涂片的厚度灵活掌握，一般为20～30s。 （6）水洗。同单染色（7）复染。滴加稀释石炭酸复红染色液，染色1～2min或滴加沙黄染色液染色2min。（8）水洗、干燥。同单染色。 （9）镜检。 干燥后用油镜观察。 染成蓝色或蓝紫色的细菌称为革兰氏阳性菌； 染成红色的细菌称为革兰氏阴性菌。 （五）实训结果（六）思考题细菌染色前为什么要固定？