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微卫星dna标记的应用 微卫星dna标记是经过rill技术开发的下一代分子遗传标记技术。微卫星DNA的PCR产物检测方法主要有同位素标记引物的聚丙烯酰胺电泳法、荧光标记引物的测序法以及聚丙烯酰胺凝胶电泳银染法等。自20世纪80年代以来, 经过二三十年的不断发展, 微卫星DNA标记技术因其数量大、分布广且均匀、多态性丰富、呈孟德尔共显性遗传、检测快速方便以及结果稳定可靠等优点, 已被广泛应用于各个领域。 1 简单重复序列和分子标记的发展 1974年, Skinner等在研究寄居蟹的基因组时发现了微卫星DNA的重复序列。此后, 在人、动物和酵母的基因组中都发现了类似大量的简单重复序列。直到1986年, Ail等首次用合成的微卫星寡核苷酸作为探针用于人的指纹分析, 这时才得到重视。1988年, Jeffreys等人做了进一步的研究并使之发展成为新的遗传分子标记系统。1989年, Litt等[1扩增到了人类基因组微卫星序列, 从而创造了“微卫星 (microsatellite) ”这个名称。 2 ts与str 微卫星DNA又称简单重复序列 (simple sequence repeats, SSR) 或短串联重复序列 (short tandem repeats, STR) , 是指以少数几个核苷酸 (一般是1~6个) 为单位串联重复的DNA序列。这些重复序列的重复次数和重复程度在不同的生物体内高度变化, 并且随机分布于真核生物基因组中。普遍认为, 在染色体上, 除着丝粒及端粒区域外, 其他区域也广泛散在分布有微卫星位点。Weber根据微卫星核心序列排列方式的不同, 将其分为完全 (无间隔) 、不完全 (有非重复单位的碱基间隔) 和复合型 (2个或更多重复单位彼此毗邻连续出现) 微卫星3种类型。 3 私卫星dna标记的优点 3.1 微卫星标记的特点 (1) 分布广泛。微卫星DNA广泛且均匀地分布于真核生物基因组中。 (2) 多态性丰富。由于微卫星在不同个体中的重复单位数目变异大, 因而造成其长度具有高度的多态性, 使其可以包含大量丰富的信息。 (3) 简易高效安全性。微卫星检测方法简便且效率高, 单个位点检测时间很短, 一般不超过24 h, 并可以多个位点同时进行检测。微卫星标记没有任何表型效应, 因而不存在对家畜个体的有害或次级效应。 (4) 保守与通用性。微卫星侧翼序列的保守性以及物种间某些染色体区段的共线性, 某一物种的微卫星引物可以应用于相近物种。 (5) 共显性遗传。微卫星标记的等位基因遵循孟德尔共显性遗传, 因而易区分纯合型和杂合型。3.2缺点 (1) 建立和筛选基因文库, 进行克隆和测序, 都是非常繁琐、耗时的工作。 (2) 由于不同物种的微卫星侧翼序列不尽相同, 因此针对不同物种设计相应的特异性引物也非常耗时。 (3) 微卫星进化具有复杂性, 可能出现同源异型或异源同型。 (4) PCR扩增受许多因素的影响, 使一些等位基因无法被扩增出来, 即“无效基因”。影响亲子鉴定的正确性。 (5) 目前还没有发现哪个DNA探针能很好地匹配他们各自的多态性。 4 私卫星dna标记的应用 4.1 微卫星位点和标记的定位与构建 微卫星DNA既可作为探针用于杂交分析, 又可以根据其后序列设计引物, 进行PCR扩增、检测。因而, 构建遗传图谱非常有效。以微卫星位点为基础在基因组中每隔一定距离找一个多态的微卫星标记, 当这些标记达到一定的饱和度, 也就构建出了遗传连锁图。随着使用微卫星标记制作基因图谱的标记数量的增加, 饱和度日趋增大, 平均距离逐步缩小, 遗传图谱的精确度随之提高。 4.2 微卫星标记法 近年来, 遗传图谱的进展主要是依赖于分子遗传学标记, 特别是微卫星DNA标记的不断发现, 利用微卫星与功能基因和QTL间的连锁关系, 使遗传图谱上定位的功能基因和QTL不断增加。Ashwell等通过微卫星位点将一个控制奶牛体细胞评分的QTL定位于牛的23号染色体上, 将牛的双肌基因MH定位于牛的2号染色体上, 与微卫星标记TGLA-44相连锁。Georges等首次在美国核心奶牛群中用159个微卫星位点进行基因组分析, 在第1, 6, 9, 10和20号染色体上发现了对产奶性状有影响的QTL。另外, 畜禽的大多数重要经济性状表型值受许多基因与环境因子共同作用, 在实际生产中难以选择确定, 利用微卫星标记与某些功能基因或QTL的连锁关系, 可对功能基因在染色体上的位置及其效应进行确定和跟踪, 计算出单个QTL产生的效应值, 有效提高品种选育的选择效率, 大大提高了人们对数量性状优良基因型选择的准确性和预见性。Forster等使用单标记退化、单内部图谱和复合内部图谱方法, 对多年生黑麦草进行了QTL分析, 在5个不同的样本中观察到42个QTL,