小鼠肝脏组织总RNA的提取及RT-PCR 完整版.pptVIP

一 小鼠肝脏组织总RNA的提取（Trizol法提取） 目的： 1.掌握组织细胞中总RNA提取的基本原理 2.熟悉Trizol法提取总RNA的原理和操作 原理: Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，再加入氯仿后形成两相，变形的DNA与蛋白质位于两相的交界面，RNA保留于上层水相 Trizol适用于从多种组织和细胞中快速分离总RNA 器材与试剂： EP管、加样枪、离心机、振荡器、匀浆器、Trizol Reagent 、氯仿、异丙醇、75%乙醇、DEPC水 标本：小鼠肝脏 操作： 1．秤取组织：先剪碎小鼠肝脏组织，称量100mg组织，加1.0ml的 Trizol，用匀浆器匀浆 2.各层相分离：室温静置5分钟，12000转/分，4℃离心10分钟，将上清液转移到另外一个EP管中 3．加入1/5体积的上清液量的氯仿，剧烈振荡混匀30 4．12000转/分，室温离心10分钟  5．将上清液小心转移到RNase-free 1.5ml离心管里，加入与上清等体积的异丙醇，室温下放置10min， 【注意：不要吸取任何中间层物质，否则会出现Genomic DNA污染】 6.12000转/分，4℃，离心10分钟,离心后分层：酚-氯仿层、中间层、 无色水相层（RNA） 7.小心移去上清液，防止沉淀丢失   8.用75%酒精（用DEPC水配置）洗涤，每次1ml，12000转/分，4℃，离心5分钟  9．尽可能彻底地吸走上清，同时防止丢失RNA沉淀  10. 室温下干燥3-5分钟使酒精充分挥发  11. 视沉淀物的多少用50ul DEPC-H2O溶解 思考题： 1.哪些原因可导致RNA被降解？ 2.如RNA得率比较低，最可能出现的原因是什么？ 二、 RNA的琼脂糖电泳 【试剂准备】 所提取动物组织总RNA 10×Loading Buffer  Goldview 琼脂糖 TBE缓冲液 操作步骤： 1、用电子分析天平称取1g的琼脂糖放入三角烧瓶 2、将5×TBE用去离子水稀释到0.5×TBE工作液 3、用100ml量筒量取100ml 0.5×TBE到三角烧瓶中 4、将三角烧瓶的口用厚纸包严以防止挥发 5、将三角烧瓶放在微波炉中加热3～4分钟到完全融化 6、将三角烧瓶放置于室温冷却到不烫手 7、加入Goldview(EB替代品) 5μL摇匀，倒入制胶模具中 8、等琼脂糖完全凝固后拔去梳子，连塑料托底一起放入电泳槽中 9、取10μL所提取的肝脏总RNA，用2μL10×Loading Buffer混合后加入胶孔中 10、150V ，电泳15min，用凝胶成像仪器成像 三、CDNA的合成 RT-PCR 方法由从RNA 合成cDNA的逆转录反应和对此cDNA 进行扩增的PCR 反应组成 PCR 中如果扩增了错误的DNA 序列的话，将有可能损坏目的基因本来具有的机能的风险 操作 逆转录反应： （1）制品内容 5× primscipt@ RT Master Mix RNase Free dH2O 5× primscipt@ RT Master Mix中含有RT-PCR中含有的反转录反应所需要的所有试剂（primscipt RTase , RNase inhibitor , random 6 mers, Oligo dT primer , dNTP Mixture , 反应Buffer）, 加入模扳RNA 和水就可迅速进行反应 （2）逆转录反应：  （3）反转录反应条件如下： 37℃ 15min (反转录反应) 85℃ 8sec （反转录酶的失活反应） 4℃ （4）得到的CDNA可用于下一步的PCR反应 *