败酱草对lps活化wisar大鼠腹膜巨噬细胞分泌nf、il-1、-pa及pai的调控作用.docxVIP

败酱草对lps活化wisar大鼠腹膜巨噬细胞分泌nf、il-1、-pa及pai的调控作用 由于发病率高、治疗难度大，囊肿连接一直是临床外科过程中的难题。巨噬细胞作为机体的重要防御细胞, 参与了腹膜粘连形成过程中的炎症反应、纤维蛋白沉积、溶解以及机化和浆膜修复等多个环节。败酱草作为败酱科多年生草本植物, 具有清热解毒、消痈排脓、祛淤止痛之功效。本研究观察了离体状态下, 败酱草对LPS刺激下Wistar大鼠腹膜巨噬细胞 (即活化的巨噬细胞) 分泌肿瘤坏死因子 (TNF) 、白细胞介素-1 (IL-1) 、组织纤维蛋白溶酶原激活剂 (t-PA) 、纤溶酶原激活剂抑制因子 (PAI) 的变化, 探讨败酱草对腹膜粘连的干预作用, 从而试图寻求防治腹膜粘连的药物。 1 培养所得细胞中tnf及il-1,t-pa及pai的表达 巨噬细胞培养自健康Wistar大鼠10只 (购自军事医学科学院实验动物中心) , 雌雄各半, 周龄3～4周。培养所得细胞平均分为4组, 分别为:RPMI-1640组、RPMI-1640+LPS组、RPMI-1640+败酱草组以及RPMI-1640+LPS+败酱草组。以上4组在不同反应体系中均检测TNF, IL-1, t-PA及PAI的分泌水平。 实验所用败酱草由天津医科大学药学院提供, 制作浓度为1 g生药/ml。 2 方法 2.1 重组细胞的制备 实验所需动物以颈椎脱臼法处死, 用75%乙醇浸湿全身。然后将其仰卧四肢展开固定于鼠板上。在腹股沟区做一横切口, 撕裂皮肤以完全暴露腹壁。用注射器事先抽1 ml无菌气体和4 ml预冷的4℃培养液, 从腹部左侧向腹腔中注射。按揉或扣打腹壁2 min, 促使巨噬细胞从腹膜的浆膜表面释放, 形成细胞悬液, 抽出悬液。移入离心管内1 500 r/min离心15 min液, 去上清液。用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液调细胞数达到1×105/ml, 细胞加入96孔板, 每孔细胞2×104个, 共27个孔, 分为3组, 每组3个复孔, 重复3次。LPS终浓度为10 μg/ml, 反应体系200 μl;中药的生药浓度为20 mg/200μl, 培养6 h, 收集上清-20℃冻存, 供TNF, IL-1检测用。 2.2 指标和方法的检测 TNF及IL-1检测采用MTT法;t-PA及PAI-1的检测采用酶联免疫吸附双抗体夹心法。 2.3 统计方法 计量资料以xˉ±sxˉ±s表示, 采用方差分析进行统计学处理, P0.05表示差异有统计学意义。 3 败酱草醇提物对pai表达的影响 巨噬细胞在LPS作用下进入活化状态, 分泌TNF,IL-1 水平增加 (P0.05) , 而t-PA分泌水平有增加趋势, 而PAI分泌水平增加显著 (P0.05) ;在未活化巨噬细胞中, 单独加入败酱草对其分泌TNF,IL-1,t-PA和PAI的水平没有显著影响 (P0.05) ;在活化巨噬细胞基础上, 加入败酱草后TNF、IL-1分泌水平显著下降, 同时PAI分泌水平下调 (P0.05) , 但对t-PA的分泌没有显著影响。见表1。 4 败酱草的药代动力学 腹腔内感染、炎症及腹膜损伤是腹膜粘连形成的重要启动因素, 而巨噬细胞是参与腹膜粘连形成的主要细胞成分。腹膜损伤时, 局部血管渗透性增强, 伴随炎症细胞渗出, 最终导致纤维蛋白基质形成。纤维蛋白基质很快机化并被含有成纤维细胞、巨噬细胞的组织代替, 纤维蛋白基质连接两个受损伤的腹膜行成纤维索带。Saba等在研究中发现, 术后早期血清TNF和IL-1高水平与术后腹膜粘连程度显著相关, 认为TNF和IL-1术后早期升高可作为人类术后腹膜粘连形成可靠的生物学标志。本实验显示, 在巨噬细胞受到LPS刺激时, 即感染引起巨噬细胞活化后, 炎症细胞因子TNF、IL-1分泌增加, 而败酱草可以明确下调活化的巨噬细胞分泌TNF、IL-1的水平。在祖国医学中, 败酱草具有清热利湿, 解毒排脓, 活血化淤作用, 是常用的中草药之一。目前发现的败酱草化学成分以三萜皂苷类居多, 也有环烯醚萜类、香豆素类、甾醇类、黄酮类、挥发性化合物等。有研究表明, 败酱草能增强网状细胞和白细胞的吞噬能力, 促进抗体形成及提高血清溶菌酶的水平, 从而达到抗菌消炎的目的。 在腹膜粘连中, 腹膜的机械损伤、组织缺血、感染、异物等均可导致腹膜损害, 引起一系列多系统、多细胞及多细胞因子参与的反应, 其中纤维蛋白的沉积和降解是腹膜粘连形成中最重要的决定因素, 腹膜纤溶又在其中起关键作用。当覆盖了纤维蛋白胶元的两块腹膜并列时就形成一条粘连带, 因此, 粘连是否形成取决于术后5～7d。腹膜纤溶系统可溶解纤维蛋白胶元。但是, 手术可减弱溶解纤维蛋白的酶的活性, 其途径为:①降低t-PA的水平;②增加PAI的水平