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反-10,顺-12cla对山羊乳脂合成抑制作用的影响 低脂肪率是指由日常食物因素引起的牛奶的低脂肪产量和脂肪量降低的。通常，高脂肪和低脂肪的日粮和补饲脂肪会导致低脂肪率的降低。在某些情况下，这种琼脂率降低了50%。随着我国奶牛业的快速发展,以质论价已是原料奶收购中的普遍做法,乳脂降低问题引起了生产者和研究人员的普遍重视。 当前对MFD的解释有瘤胃生物加氢饱和学说和葡萄糖-胰岛素学说。瘤胃生物加氢饱和学说认为,在特定日粮条件下瘤胃内环境发生改变(主要是pH降低),导致多不饱和脂肪酸瘤胃生物加氢饱和代谢途径发生变化,产生了对乳脂合成有强烈抑制作用的特殊类型的不饱和脂肪酸,从而使乳脂合成降低。最近一些研究工作为瘤胃加氢饱和学说提供了强有力的试验证据[5,6,7,8,9,10,11,12,13]。葡萄糖-胰岛素学说则认为,在高精料/低粗料日粮条件下,瘤胃发酵的丙酸比例增加刺激胰岛素分泌,改变了脂肪酸合成前体在体组织和乳腺组织之间的分配,从而抑制了乳脂的合成。 瘤胃加氢饱和学说可以解释奶牛日粮中添加不饱和脂肪酸(鱼油、植物油等)及饲喂高精料日粮引起的MFD,前者是因为增加了反-10,顺-12 CLA合成的前体,后者则因为形成了有利于其合成的瘤胃内环境。但给泌乳奶山羊补饲植物油、鱼油的试验未能引起乳脂率的下降,甚至乳脂率还有所升高,其原因既可能是奶山羊的乳脂合成不受反-10,顺-12CLA的抑制,也可能是相关试验中添加鱼油或植物油虽然提高了瘤胃反-10,顺-12CLA的产量,但仍未达到抑制乳脂合成的阈值剂量。本研究的目的是验证反-10,顺-12CLA对山羊乳脂合成是否有抑制作用及了解其机理,以期为MFD发生机制的阐明提供试验证据。 1 材料和方法 1.1 试验羊及日粮加工 选用4只体况、胎次、年龄、产奶量和乳脂率相近的泌乳中期崂山奶山羊,体质量(45±5)kg。正式试验前1个月给羊只做颈动脉游离手术,并安装永久性真胃瘘管。试验日粮按AFRC设计,以干地瓜秧为主要粗饲料,与精料混合加工成颗粒料。每只试羊日喂量1.7 kg,可满足体质量45 kg、日产奶量1 kg、乳脂率3.5%、乳蛋白率3.5%试羊的营养需要(表1)。 1.2 样品采集和测定 采用4×4拉丁方设计,4个试验处理为真胃灌注0、2、4和8 g·d-1共轭亚油酸(CLA)乳液(青岛奥海生物有限公司,成分见表2),灌注剂量确定参考Chouinard等,各组灌注的CLA中分别含有0、0.784、1.568和3.136 g·d-1的反-10,顺-12CLA。每天灌注的CLA用脱脂乳乳化,配制成250 mL的乳液,间隔4.8 h分5次注入真胃,每次灌注量 每期试验7 d,预灌注期为4 d,采样期3 d,2期试验之间间隔10 d。每天按饲养标准饲喂羊只1.7 kg左右饲料,自动喂料器每2 h饲喂1次,自由饮水,每天记录进食量。日挤奶2次,分别在06:00和18:00各1次。奶样按比例混合取样。一份加入防腐剂4℃保存,用于乳成分测定;另一份不加防腐剂-20℃保存,用于乳脂脂肪酸测定。取乳样提取粗脂肪,经酸碱甲酯化处理后用色谱纯正己烷提取脂肪酸,气相色谱法测定乳脂脂肪酸含量。 试验期第3天早上挤奶后开始灌注马尿酸(PAH),在灌注的1、1.5、2.0和2.5 h时分4次同时采集颈动脉和乳静脉血样约10 mL置于肝素钠抗凝试管中,离心(3 000 r·min-1,15 min)取血浆后于低温保存颈动脉和乳静脉血浆均测定挥发性脂肪酸(VFA)、NEFA、甘油三酰(TG)和PAH含量,颈动脉血浆测定胰岛素、血糖含量。气象色谱法测定脱蛋白血浆VFA含量,试剂盒法测定NEFA、TG含量(南京建成生物工程研究所),放免测定胰岛素含量(试剂盒购自北京北方生物技术研究所,GC-911型10管放射免疫γ计数器),酶反应法(美国强生血糖测定仪)测定血糖含量,PAH测定参照Katz等的方法。 每期试验的第8天早上挤奶后4～5 h活体采集取对照组和8 g·d-1CLA灌注组试羊乳腺组织样品。取样前约15 min在取样部位环形注射盐酸普鲁卡因,于右侧乳房正中做2～3 cm皮肤切口,钝性剥离结缔组织,暴露乳腺组织。取约200 mg乳腺组织立即在液氮中冷冻并在-80℃保存。羊肠线缝合腺体和结缔组织,手术缝合线结节缝合皮肤。活体组织取样后2 h内挤奶1次。为预防试羊感染,乳腺组织采样后连续4 d肌肉注射青霉素(320万单位·天-1)和链霉素(40万单位·天-1)。 实时荧光定量PCR法测定乳腺组织乙酰CoA羧化酶(ACC)mRNA表达量,以β-actin为参照基因,倍比稀释法测定标准曲线。反应时,每个样品的参照和目的基因均在同一反应板上进行扩增,使用相同的优化扩增程序,以最大限度地保证参照和目的基因具有相同的扩增效率将相同