成纤维激活蛋白31、尿激酶型纤溶酶原激活剂受体与卵巢癌细胞侵袭、迁移和增殖的关系.docxVIP

成纤维激活蛋白31、尿激酶型纤溶酶原激活剂受体与卵巢癌细胞侵袭、迁移和增殖的关系 机制三:成纤维细胞激活蛋白和upa 肿瘤的入侵和转移是一个多步走的过程，主要包括三个阶段：细胞粘附、细胞外基质分解和细胞转移。 整合素介导着细胞与细胞之间的黏附, 是肿瘤发生侵袭转移的前提, 同时又有一些降解细胞外基质的蛋白水解酶的参与, 将细胞外基质降解, 从而利于肿瘤细胞发生侵袭和转移。 成纤维细胞激活蛋白 (fibroblast activatin protein , FAP) 作为一种丝氨酸蛋白酶, 可以水解基质中许多底物、降解ECM, 利于肿瘤细胞从原发部位脱离, 从而促进肿瘤的侵袭和转移。uPA是一种多功能丝氨酸蛋白酶, 它与肿瘤细胞表面特异性受体uPAR结合后被激活使其在细胞表面的浓度大大提高, 从而可以非特异性地溶解ECM和基膜中的蛋白, 破坏ECM和基膜, 而促进肿瘤细胞向远处转移。 FAPα 是如何发挥其细胞外信号转导作用的机制尚不清楚。整合素 α3β1 的 α3 链可与uPAR相互粘着。因此, 推测通过 α3 链将整合素β1 与FAP, uPAR联结在一起, 通过粘着、 蛋白水解、信号转导三个步骤来发挥FAPα 其促肿瘤侵袭、迁移、增殖的作用。 1 材料和方法 1.1 美国ssoce-pai-1和upar抗体的扩增 高转移性卵巢癌细胞系HO-8910PM (中科院上海生物科学研究所细胞库) FAPα (台湾Abnova公司) , 整合素 α3 抗体 (美国Santa公司) 整合素β1 抗体 (美国Santa公司) PAI-1 (美国PeproTech公司) uPAR抗体 (美国PeproTech公司) 1.2 体外分离和细胞转导 卵巢癌细胞系HO-8910PM, 加入裂解液, 离心取上清。分别加入抗整合素 α3 抗体、抗整合素 β1 抗体、抗uPAR的抗体4 ℃过夜, 加入蛋白G 4 h, 离心去上清后, 用RIPA洗沉淀, 加入loading buffer后煮沸, 离心后电泳, 转膜, 封闭1 h, 加入抗uPAR抗体、抗整合素 α3 和整合素 β1 的抗体, 4 ℃过夜孵育后, TBST洗膜, 加入相应二抗, 37℃ 1 h, 洗膜, western blot避光显色。 HO-8910PM细胞胰酶消化, 加入transwell小室上室, 下室加入800 μl 10%FBS RPMI 1640 完全培养基。 实验分为6 组: (a) 空白对照组 (b) FAPα 组对照 (c) 整合素 α3β1 抗体对照组 (d) PAI-1 (uPAR抑制剂) 组 (e) 整合素 α3β1 抗体+FAPα 组 (f) PAI-1+FAPα 组, 置于37℃孵育48 小时。取出小室乙醇固定, 苏木素染色, 用棉棒擦拭掉小室上面未穿过的细胞, 显微镜观察统计结果。 Matrigel基质胶按1:15 与无血清培养基稀释, 铺在transwell小室膜上, 放入孵箱内平衡5 小时。与步骤同上迁移实验。 96 孔板接种HO-8910PM细胞, 实验分成6 组 (分组同前) 每孔加入各种试剂20μl 37℃孵育4h。加入DMSO, 摇床振荡酶联免疫酶标仪的OD490nm处测量吸光值。 1.3 统计分析 统计分析应用SPSS统计软件, 两两比较采用Two-tailed检验, 检验水准 α=0.05。P0.05 为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 抗凝剂检测整合素3、整合素1、upa 结果表明用整合素 α3、整合素β1、uPAR其中一种抗体免疫共沉淀, Western blotting均能检测到免疫复合物中含有整合素 α3、整合素 β1、uPAR蛋白。 2.2 pai-1和整合素31的联合对fap促迁移能力的影响 FAP可以明显促进肿瘤细胞的迁移作用 (如图4B) ;整合素 α3β1 能够明显抑制肿瘤细胞的迁移作用 (P0.0001) (如图4C) ;整合素 α3β1 能够抑制FAP对肿瘤细胞的促迁移作用 (如图4D) ;PAI-1 对肿瘤细胞迁移能力无明显影响 (如图4E) ; PAI-1 对FAP促迁移能力的影响不明显 (如图4F) 。 统计学分析FAPα 可促进细胞的迁移 (*P0.05) 、整合素 α3β1 抗体及FAPα 与整合素 α3β1 抗体联合可显著减少细胞的迁移 (** P0.01) ;PAI-1 及PAI-1 与FAP联合组均无明显统计学意义 (见图3) 。 2.3 抗体对肿瘤细胞致病性的影响 结果显示, FAPα 可以明显促进肿瘤细胞的侵袭作用 (如图4A) ;整合素 α3β1 抗体能够明显抑制肿瘤细胞的侵袭作用 (如图4C) ;整合素 α3β1 能够抑制FAP对肿瘤细胞的促侵袭作用 (如图4D) ;PAI-1 对肿瘤细胞的