基于16srdna技术的rb-19微生物群落指纹图谱研究.docxVIP

基于16srdna技术的rb-19微生物群落指纹图谱研究 生物膜防水好氧循环系统（bis）具有脱水法和好氧法的优点。它不仅能有效地分解环境中严重的芳类化合物，而且能有效分解稳定的化学结构和难以分解的氨基酸和磺酸。在这些降解过程中,系统内的微生物起着至关重要的作用。然而,到目前为止,各种研究主要集中在工艺优化上,对系统中起主要降解作用的功能微生物缺乏相应的了解。点亮这个“暗箱”,充分了解系统中各种微生物在降解过程中的作用,对优化系统运行、提高处理效果都具有重要的实际应用价值和理论探索意义。 近年来,随着现代分子生物技术的发展,有关不同的处理工艺内污泥或生物膜中微生物群落结构的研究在国内外均取得了一定的成果。肖勇等采用PCR-DGGE技术研究处理垃圾渗滤液序批式生物膜反应器(SBBR)中的细菌多样性,结果表明,在该SBBR中有多种硝化细菌与反硝化细菌、好氧反硝化细菌和厌氧氨氧化细菌共存;刘惠军等利用FISH技术分析炭膜曝气生物膜反应器硝化作用及其微生物群落结构,结果显示生物膜内亚硝化单胞菌(Nitrosomonas)和亚硝化螺菌(Nitrosospira)为亚硝化细菌优势菌种;陈谊等采用PCR-DGGE技术对膜生物反应器中不同阶段微生物群落结构演变研究时发现,微生物的群落结构能随着反应器运行状况的变化做出调整恢复。为了更为深入地探索BHARS中微生物群落的多样性和演变规律,本研究首先考察BHARS对不同浓度的活性艳蓝的降解情况,其次利用变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)分析上述情况下系统功能微生物的群落动态变化。 1 材料和方法 1.1 特殊布 活性艳蓝(C.I. Reactive Blue 19)由厦门华伦集团提供,使用前不经过纯化。其他试剂均是分析纯。 1.2 废水生物处理系统和工艺流程 接种污泥取自前埔污水处理厂曝气池(厦门,中国),并分别装入好氧、水解反应器用不含活性艳蓝的培养基进行培养,2周左右生物膜稳定,好氧生物膜总量20±1 g(干重),水解膜总量27±2 g(干重)。反应器均采用有机玻璃柱制成,好氧反应器容积为6 L,水解反应器容积为5 L ,反应器内挂有软性纤维(D-2型,浙江玉环环保器材厂),具体参数如表1所示。水解反应器的温度控制在35±1 ℃,溶氧0.4～0.6 mg/L;好氧反应器的温度20～25 ℃(室温),空气流量为2 L/min,溶氧4.5～6 mg/L。系统循环流量为10 mL/min,工艺流程如图1所示。 模拟废水的组成:活性艳蓝(RB-19),C6H12O62 g/L,NaHCO31.5 g/L,NH4Cl 0.191 g/L,KH2PO40.044 g/L。微量元素:CaCl2·6H2O 0.01 mg/L, FeSO4·7H2O 1.55 mg/L, MnSO44.95 mg/L, ZnSO4·7H2O 0.71 mg/L, CuSO4·5H2O 0.48 mg/L, CoCl2·6H2O 0.01 mg/L。活性艳蓝的初始浓度为100 mg/L,当色度和COD降解率稳定后(大概需要12 d),从2个反应器中的生物膜上取样保存。完成后,将活性艳蓝浓度提高到200 mg/L,重复以上操作,直至浓度达到500 mg/L。 1.3 pcr反应体系 污泥中基因组DNA提取采用上海申能博彩的环境样品DNA提取试剂盒(3S DNA Isolation Kit V2.2)。PCR反应在MJMini Personal thermal cycle(Bio-rad)上进行,采用不同的引物扩增细菌和古细菌中V3-V5中的特异片段,具体针对细菌选择引物F338-GC和R518,针对古细菌选择引物ARC334-GC和ARC915。 50μL反应体系组成:1μL模板,5μL的10×PCR buffer (MgCl2),2μL dNTP,1μL每种引物,0.5μL Tap 酶(Takala),其余用无菌超纯水补足。PCR扩增程序(细菌)为:起始94 ℃预变性2 min,94 ℃变性45 s,61 ℃延伸45 s,72 ℃复性45 s,30个循环,72 ℃终延伸10 min,4 ℃保存。扩增古细菌采用Touchdown模式,具体程序如下:95 ℃预变性5 min,95 ℃变性45 s,63～53 ℃延伸45 s,72 ℃复性45 s,20个循环(每个循环退火温度降低0.5 ℃),95 ℃变性45 s,53 ℃延伸45 s,72 ℃复性45 s,13个循环,72 ℃终延伸10 min,4 ℃保存。 1.4 sybrger染色 采用Bio-rad公司的DcodeTM系统,凝胶浓度为8%,变性梯度为30%～70%,温度为60 ℃,缓冲液为1×TAE,电压25 V,20 min,电压为150 V,4.5 h,完毕后将凝胶进行