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一种瘤胃微生物的dna提取方法 0 瘤胃微生物干产品的制备方法 肿瘤胃的微生态系统极其复杂，包括许多微生物，如肿瘤、古细菌、原虫和真菌。研究表明,瘤胃内细菌数量最多,高达1010～1011个/mL(200多种);原虫数量为104～106个/mL(25个属);厌氧真菌游动孢子数为103～105个/mL(6个属);噬菌体颗粒数高达107～109个/mL。反刍动物瘤胃利用这些复杂的微生物的协同作用,将饲料中的植物纤维类物质快速降解转化成动物营养和能量物质。过去对瘤胃微生物的研究主要是采用传统纯培养技术,但是由于瘤胃微生物要求严格的厌氧条件,因此较难在体外进行种群研究。随着分子生物学的发展,基因组DNA水平上的研究方法得以应用,并很好地实现了对复杂瘤胃微生物的研究。目前瘤胃微生物DNA提取采用较多的是珠磨仪破碎法、反复冻融SDS/蛋白酶K法、液氮研磨法,这些方法有些需要特殊仪器,有些在操作过程中容易造成DNA降解。本试验旨在研究不需要特殊仪器情况下,也可以获得完整微生物信息的DNA提取方法,为瘤胃中的细菌、古细菌、真菌和原虫4类微生物DNA后续分子研究提供更好的实验材料。 1 材料和方法 1.1 体外瘤胃模拟培养方法 瘤胃体外培养物是通过采集装有永久性瘤胃瘘管的牛瘤胃液,以稻草粉、玉米粉和黄豆粉为饲料底物,采用本研究小组改进的体外瘤胃模拟装置培养24 h后的培养物,详细过程参见张志红等方法。样品采集后置于-20 ℃用于DNA提取。 1.2 sds-pcr法 瘤胃培养物低温12 000 g高速离心10 min,弃上清;沉淀加入适量预热的DNA提取缓冲液(100 mM Tris-HCl,100 mM EDTA,1.5 M NaCl,1% CTAB,pH 8.0,用前置于65 ℃水浴预热),充分混匀。置液氮中完全冻结(液氮中冷冻约5 min) ,取出在65 ℃水浴中保温至完全融化,反复冻融3次。65 ℃保温30 min,加入溶菌酶使其终浓度达到1 mg/mL,37 ℃ 180 r/min 振荡30 min;加入10%SDS至终浓度2%,混匀后58 ℃保温2 h, 每隔15～20 min颠倒混匀数次。室温下6 000 g离心10 min,收集上清液。加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25:24:1),轻轻颠倒混匀,防止DNA断裂。室温下12 000 g离心10 min,吸取上层液体,加入0.6倍体积的异丙醇,室温沉淀2 h;4 ℃下12 000 g离心10 min,沉淀用70%冷乙醇漂洗3次,自然干燥;沉淀用TE(pH=8. 0)溶解过夜,用0.8%琼脂糖凝胶检测DNA。最后DNA置于-20 ℃保存备用。 1.3 dna的纯化 采用割胶回收试剂盒(EZ Spin Column DNA gel Extraction Kit)纯化DNA,取5 μL纯化后的DNA用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。 1.4 引物检测微生物 采用细菌16s rDNA通用引物、古细菌16s rDNA通用引物、真菌18s rDNA通用引物及原虫特异性引物分别对瘤胃总DNA中细菌、古细菌、真菌及原虫4类微生物进行检测。引物具体序列及4种微生物PCR检测条件分别见表1、表2。反应体系为25 μL体系:模板DNA 0.5 μL,上、下游引物(10 μM浓度)各1 μL,2×Easy Taq PCR Supermix 12.5 μL,ddH20补足体积至25 μL。 2 结果与分析 2.1 粗提dna产物的琼脂糖检测 体外培养时添加的植物提取物颜色较重,因此,瘤胃内容物粗提获得的DNA也稍带黄色。粗提DNA产物经琼脂糖检测(见图1),片段的大小接近20 kb,由于粗提产物中含有较多的酚、多糖等杂质,所以上样孔内有亮带,并出现拖尾现象。因此,如要获取用于后期分子生物学研究的DNA,需经过纯化获得较纯的DNA。 2.2 pcr检测dna 粗提DNA产物经过DNA纯化试剂盒纯化后获得的DNA产物无色,经琼脂糖电泳检测(图2),目的长片段DNA有部分损失,但浓度仍较高。而且上样孔无亮带,说明杂质已经去除干净,可用于后期的分子研究。 2.34 瘤胃内容物微生物多样性分析 纯化后的DNA利用4种微生物的特异性引物扩增后均获得目的大小的片段(见图3),细菌16s rDNA扩增产物大小为1 500 bp、古细菌16s rDNA扩增产物大小为756 bp、真菌18s rDNA扩增产物大小为1 800 bp、原虫特异性扩增产物为 1 360 bp,说明采用体外培养的瘤胃内容物存在细菌、古细菌、真菌及原虫4种微生物。同时也说明液氮反复冻融和相关试剂提取以及试剂盒纯化的方法可有效提取和纯化瘤胃微生物DNA,所获得的DNA产物可用于后期实时定量PCR和DGGE等分子研究。 3 总dna的提取 由于传统方法不能够