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2-cp驯化前后厌氧颗粒污泥中微生物种群结构的变化 氯酚类作为重要的工业原料使用广泛。由于其毒性和易分解性对环境的污染面广、影响大，美国环境管理局（epa）和中国将氯酚类物质作为主要控制对象。与传统的物理、化学法和好氧生物处理技术相比，厌氧污泥微生物脱硅反应是减少氯酚类物质的有效途径。厌氧消化是多种微生物相互作用的过程，而酸菌和厌氧菌在厌氧器的运行中起着重要作用。因此，我们必须研究这些微生物的结构分布，了解这些微生物的生态，对顺利实施厌氧处理系统和提高有机物质的分解效率具有重要意义。 由于传统研究方法的局限性,产甲烷菌的代谢作用还没有象其他类群的细菌那样被广泛研究,酸杆菌的确切功能和生态特性目前仍不是很明确.近年来,基于16S rDNA 克隆技术鉴别微生物组成的方法已广泛应用于各种环境样品,这些方法无需分离培养就可以反映微生物的群落结构信息. 本研究使用基于16S rDNA 的克隆技术,从厌氧颗粒污泥直接提取总DNA,用古细菌和酸杆菌特异性引物进行PCR扩增、克隆、测序及序列分析等,以考察经2-CP驯化前后厌氧颗粒污泥中古细菌和酸杆菌的种群结构变化,以期为在分子生物学水平上阐明降解2-CP厌氧污泥颗粒的微生物种群信息、提高有机物的厌氧降解效率提供一定的理论依据. 1 材料和方法 1.1 cod和2-cp的驯化 接种污泥选用无锡罗氏柠檬酸厂IC厌氧反应器污泥.反应器内径50 mm,外径80 mm,总高度400 mm,有效容积0.75 L.用葡萄糖和2-CP共同驯化,进水COD控制在2 000 mg/L左右,并按比例加入所需的营养盐.水力停留时间(HRT)控制在12 h左右,pH为7.5～8.0,温度为37℃±1℃.当进水2-CP浓度达到25 mg/L,COD和2-CP的去除率90%时说明驯化成功.COD的测定采用国家标准法(GB 11914-89),MLSS和MLVSS的测定采用重量法,2-CP测定用高效液相色谱(HPLC)法. 1.2 总dna的提取和测定 取接种污泥及厌氧反应器内经2-CP驯化稳定后的污泥各200 mg,用蒸馏水冲洗3遍,5 000 r/min离心2 min弃去上清,用蛋白酶K、氯仿/异戊醇方法直接抽提污泥样品的总DNA,提取的总DNA中用100 μL无菌超纯水溶解,加入RNAase(终浓度100 μg/mL),37℃温育30 min.总DNA片段的大小和质量用0.8%的琼脂糖凝胶电泳(DYB-Ⅰ型电泳仪)检验,用紫外分光光度计(BioPhotometor, Eppendorf公司)测定浓度为150 μg/mL. 1.31 pcr扩增程序 为考察厌氧颗粒污泥中古细菌和酸杆菌在2-CP驯化前后的分布情况,使用古细菌特异性引物和酸杆菌特异性引物扩增16S rDNA,引物由Invitrogen生物技术有限公司合成,具体信息见表1. PCR反应在Mastercycler Gradient(Eppendorf公司)上进行,50 μL的反应体系为:10×PCR反应缓冲液5 μL,10 mmol/L的dNTP溶液1 μL,10 mmol/L的引物对各1 μL,Taq酶2个单位,样品DNA溶液2 μL, 加无菌双蒸水补足至50 μL. 古细菌的PCR扩增程序为:94℃预变性2 min;94℃,45 s, 51℃,60 s, 72℃,90 s,30个循环;72℃,10 min.酸杆菌的PCR扩增程序为:94℃预变性2 min;94℃,45 s, 60℃,45 s, 72℃,90 s,30个循环;72℃,10 min.PCR产物经1.2%的琼脂糖凝胶电泳检验后,割下目标片段大小的条带,用胶纯化回收试剂盒进行回收和纯化(Wizard SV Gel and PCR Clean-UP System,Promega公司),用紫外分光光度计测定纯化后的PCR产物浓度. 1.4 质粒的筛选、pcr和测序 按操作说明,将纯化后的DNA片段克隆至pMD19-T Vector(Takara公司)上,取适量转化菌液涂布在选择性LB琼脂平板上,37℃培养过夜(18 h)以筛选含重组质粒的白色克隆子.为进一步验证筛选出的白色克隆子是否为阳性,挑取白色菌斑于94℃煮沸2 min以获得质粒DNA,分别用古细菌和酸杆菌引物,按照1.3节中的条件做PCR(25 μL反应体系),产物用1.2%的琼脂糖凝胶电泳验证.把经2次PCR验证并确定含目标DNA片段的白色克隆子接种于2 mL的LB母液(含50 μg/mL氨苄青霉素)中,180～220 r/min摇床振荡培养过夜(37℃,18 h),培养后的菌液送上海生工生物技术有限公司测序. 2 结果与讨论 2.1 微生物对2-cp的降解能力 污泥的驯化过程中逐步提高进水中2-CP的浓度,使微生物逐渐适应2-CP的毒性并