hv古细菌srp19表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达.docxVIP

hv古细菌srp19表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达 信号识别颗粒（srp）是一种由所有生物材料中的rna和沉积物组成的一般组合。它的主要功能是通过SRP循环识别并结合核糖体上新生分泌性蛋白质的信号肽序列,介导此类蛋白质穿过内质网膜,被定向地运输到体内的合适部位。 SRP RNA和SRP54蛋白是所有生物的SRP所共有的两种根本的成分。大多数细菌的SRP,仅含有上述两种成分;古细菌的SRP,除了SRP RNA和SRP54蛋白外,还含有SRP19蛋白;而人类的SRP,则含有1条RNA分子和6条多肽链,它们分别是SRP 9/14异二聚体、SRP19、SRP54、SRP68和SRP72蛋白。SRP的功能必须在全部成分聚合形成颗粒后才能发挥,其颗粒的形成以SRP19结合SRP RNA为开始,因而SRP19对诱导SRP 颗粒的形成具有重要的作用。 SRP在进化上高度保守,不同种系的SRP成分在结构和功能上有很大的一致性。古细菌是最原始的生物形式之一,令人难以置信的是古细菌SRP RNA的二级结构与真核细胞的十分相似,某些古细菌SRP RNA可以替代人的SRP RNA用于研究SRP的结构和功能,这是因为已有的研究结果表明,古细菌SRP RNA在结构与功能上均与真核细胞的相似。有关古细菌SRP的研究多年来一直是国外的热点。研究古细菌的SRP,可以从最早期的生物中获得蛋白质生物学的信息,为进一步研究SRP的作用机制以及为阐明到目前为止仍未明了的蛋白质的跨膜运输的分子机制奠定基础。古细菌的SRP因SRP54蛋白的结构较细菌的完整,同时含有细菌所没有的SRP19蛋白;它的SRP成分虽较真核细胞的简单,但功能却与真核细胞的SRP相似。因此古细菌的SRP比一般的模式生物有更多的优点。 Halophilic archaeonHaloferax volcanii(Hv古细菌)是一种细胞浆内Na+和K+含量极高在高盐环境下生长良好的微生物。Hv古细菌属于蓝杆菌科(Halobacteriaceae)之富盐杆菌属(Haloferax),又称作极端嗜盐古细菌。本文报道Hv古细菌的SRP19蛋白表达载体的构建、表达、纯化、生物学活性的研究及环境因素(高盐)对SRP蛋白与SRP RNA相互作用的影响。 1 材料和方法 1.1 dna的合成 Hv古细菌SRP RNA (Hv SRP RNA)的质粒pHvSR的制备与pET23d-Hv SRP19表达载体的构建相似,也是通过体外合成的方式获得的,因为篇幅所限另文报道。 SRP RNA合成的试剂盒(MEGA短转录试剂盒)购自Ambion公司,DH5α和BL21(DE3)pLysS感受态细胞自行制备,限制性内切酶NdeI、Hind III及StyI购自New England Biolabs公司,Q-Sepharose阴离子交换层析柱及FPLC蛋白纯化系统为Amersham Biosciences公司产品,透析袋购自Spectrum公司,质粒DNA小抽试剂盒为Fermentas公司产品,质粒DNA大抽试剂盒及蔗糖购自Sigma公司,16×76mm的Quick-Seal离心管、NVT65转头及离心机为Beckman公司产品。 1.2 重组质粒的构建 pET23d-HvSRP19重组质粒表达载体是根据GenBank注册序列号为AY138586的Hv基因组的序列,通过体外合成的方式,先合成具有重叠碱基的10个寡核苷酸序列(48～60个碱基):(10组寡核苷酸包含了Hv SRP19基因的完整序列,经拼接后即可获得Hv SRP19的基因。寡核苷酸序列的合成与常规的PCR引物合成相似,由公司完成。)再在ATP提供能量的条件下,由T4多核苷酸激酶催化寡核苷酸链间碱基的连接,获得Hv SRP19蛋白的基因全长DNA (279 bp),经序列分析,确定该片段含有编码Hv SRP19蛋白的完整阅读框后,在5′与3′端分别引入限制性内切酶NdeI及Hind III位点,克隆入pET23d质粒载体而构成的。序列经酶切初筛鉴定和DNA测序确定后,用常规氯化钙转化方法转化入E.coliDH5α感受态细胞中,分别用小量及大量质粒抽提试剂盒制备pET23d-HvSRP19重组体质粒。 (1)ATGGTGGAAAACGTGATTTATCCAGCGTATCTGGATGCGAGCCTGAG (2)CGCAGCGAAGGCCGCCGTGTGGCGCAGAGCGCGGCGGTGGAAGCGCCGACCGTGGATG (3)AAATTGCGAAAGCGGTGCAGCAGGTGGGCTATGATGCGGTGATTGAACGCGATAAACG (4)CTATAGCCGCGAATTTGAAACCCGCGGCCGCGTGCTGGTGAACAACGCGGATGATGCG (