hg102耐热糖苷酶基因的克隆与表达分析.docxVIP

hg102耐热糖苷酶基因的克隆与表达分析 糖苷酶（ec3.2.1.21）可诱导和分解各种糖苷酶，具有低物质含量，广泛存在于各种生物体中，具有各种生物功能。β-糖苷酶除水解作用外,还有转糖苷作用,可以合成寡糖,并可以水解纤维二糖获得葡萄糖,这是纤维素降解中的重要步骤。耐热酶最适温度从65～125℃,在应用上有更大优越性,可以提高反应速度、减少污染、增强对化学试剂的耐受力。耐热酶已应用于分子生物学(Taq酶),洗涤剂生产(蛋白酶)和淀粉加工(淀粉酶)等。 近年来,耐热β-糖苷酶研究活跃,耐热β-糖苷酶的报道有:Suofolobus solfataricus,Pyrococcus furiosus,Pyrococcus kodakaraensis,Thermotoga maritima,Thermosphaera aggregans,Thermus thermophilus。 非解朊栖热菌HG102(Thermus nonproteolyticus)是本实验室从广东温泉筛选得到的,是栖热菌属的一个新种,可以产生胞内多种糖苷酶。本文报道了该菌β-糖苷酶的基因克隆、表达和序列分析,并对酶的耐热机制作了探讨和分析。 1 材料和方法 1.1 材料表面 1.1.1 确定实验菌株 非解朊栖热菌HG102(Thermus nonproteolyticus)为本实验室筛选获得。大肠杆菌(E.coli)AS1.1739[K12r-Δ(lacIPOZY)×74]为中科院微生物所保存。质粒pUC18为本实验室保存。 1.1.2 培养温度g/ml LB培养基为大肠杆菌完全培养基,筛选时加入氨苄青霉素(100μg/mL),培养温度为37℃。非解朊栖热菌的培养基:0.8%蛋白胨,0.5%酵母膏,0.2%NaCl,0.5%乳糖,0.05%葡萄糖,固体培养基加1.5%琼脂粉,培养温度为65℃。 1.1.3 牛肠碱性磷酸酶和ph-gal 各种DNA限制酶、T4DNA连接酶购自Promega公司和宝灵曼公司;小牛肠碱性磷酸酶(CIAP)、X-Gal\,Dig-prime Labeling Kit购自宝灵曼公司;IPTG、ONPG、PNPG和琼脂糖购自Sigma公司;蛋白质分子量标准为Pharmacia产品;其它均为分析纯试剂。 1.2 重组质粒的鉴定 1.2.1DNA操作:非解朊栖热菌染色体提取按Marmur方法。其它操作按《分子克隆》,Southern杂交按Dig-prime Kit说明书进行。 1.2.2β-糖苷酶基因阳性克隆筛选:重组质粒转化受体菌E.coliAS1.1739,菌落在涂有IPTG和X-gal(方法按《分子克隆》)的Amp-LB板上37℃生长16～20h,然后在50～55℃培养约1～5h,菌落变蓝色的即为阳性克隆。 1.2.3序列测定:重组质粒在ABI 377自动测序仪上进行测定。 1.2.4序列同源性比较及序列分析:测定的DNA序列用DNASTAR Windows32进行翻译并进行序列分析、二级结构预测和绘制系统进化树;序列同源性比较用Gapped BLAST程序。 1.2.5重组β-糖苷酶水解活力测定(用ONPG法):0.1mL 4mmol/L ONPG,0.1mL pH5.8磷酸缓冲液,0.7mL H2O,混匀后于85℃保温5min,加入0.1mL酶液,反应10min,加入4mL 0.4mol/L Na2CO3溶液终止反应,420nm测定吸光度。此条件下每分钟产生1μmol对硝基苯酚的酶量为一个酶活单位。 1.2.6SDS电泳,按文献。 2 结果 2.1 重组质粒的鉴定 非解朊栖热菌HG102染色体DNA分别经HindⅢ,BamHⅠ,PstⅠ部分酶切后,分别与相同酶切并且脱磷酸的质粒pUC18连接,连接产物转化受体菌E.coliAS 1.1739,在涂有IPTG和X-gal的Amp-LB板上37℃培养,等菌落长到0.5～1mm转到50～55℃培养1～5h,在约5000个HindⅢ酶切连接转化子中挑到3个蓝色阳性克隆。阳性克隆在Amp-LB培养基37℃继续培养,经进一步鉴定具有耐热β-糖苷酶活性,3个重组质粒均含2.6kb的插入片段,重组质粒命名为pHY。重组质粒pHY经酶切鉴定,具有BamHⅠ、SacⅠ、SmaⅠ、KpnⅠ位点(见图1)。经Southern杂交鉴定,插入片段与非解朊栖热菌HG102 DNA有同源性(见图2)。重组质粒pHY在E.coliAS 1.1739中,表达了耐热β-糖苷酶活性,酶比活力提高17倍(见图3和表1)。 2.2 enbch,eth,atg及tn-gly 经序列测定插入片段含2623bp,序列中有1个KpnⅠ位点,1个SacⅠ位点,2个BamHⅠ位点,9个SmaⅠ位点。用BLAST程序与GenBank中的已有序