三苯氧胺对过表达乳腺癌耐药蛋白的jarvp16细胞的逆转耐药作用.docxVIP

三苯氧胺对过表达乳腺癌耐药蛋白的jarvp16细胞的逆转耐药作用 作为一种传统的治疗手段，化学药物治疗仍然是肿瘤治疗的一个极其重要的方法。但是,多药耐药性(MDR)的产生,常常导致化疗的失败。乳腺癌耐药蛋白(BCRP)是ATP结合盒(ATP binding cassette,ABC)转运蛋白超家族成员,与肿瘤细胞MDR的产生密切相关。本研究在JAR/VP16(VP16耐药性人绒癌细胞株)和其亲本细胞JAR中以三苯氧胺(TAM)和足叶乙叉苷(VP16)联合应用,观察TAM可否增加VP16的抗肿瘤作用,为临床上治疗过表达BCRP的肿瘤病人提供参考。 材料和方法 一、 ent、ho-1、mtt、merck-21 JAR、JAR/VP16细胞系由南京医科大学徐珊教授惠赠;TRIzol Reagent购自Invitrogen公司;Hochest 33342、Tamoxifen、MTT及DMSO均为Sigma公司产品;BCRP单抗(BXP-21)购自Merck Calbiochem公司;Western二抗为山羊抗小鼠,购自北京中杉公司。 二、 方法 1. 细胞培养的测定 人绒毛膜上皮癌细胞系JAR培养在含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中,JAR/VP16细胞培养在含11 μg/ml VP16和10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中,37℃、5%CO2培养箱中培养。细胞70%融合时用于实验。 2. 药物细胞毒性试验 取对数生长期细胞,参考有关文献行MTT法药物毒性实验,取3次实验的均值作图。 3. 细胞培养及rt-pcr检测 上游引物:5′-AGATCAGCTACACCACCTC-3′;下游引物:5′-CAAAGCCGTAAATCCATAT-3′。用TRIZOL reagent提取JAR及JAR/VP16细胞的总RNA,以AMV反转录试剂盒反转录合成cDNA,然后PCR扩增BCRP,比较两株细胞之间BCRP在mRNA水平上的差异;同时RT-PCR反应产物经1%琼脂糖电泳后切胶纯化送invitrogen公司测序。 4. 网络分析 提取细胞总蛋白,以BCRP单抗为一抗(1∶50)做Western blot,比较两株细胞BCRP蛋白水平表达差异。 5. pi免疫组化检测细胞内荧光值 取对数生长期细胞,制备成单细胞悬液,在10%/ml FBS的RPMI-1640培养液中加入Hochest 33342染液,使终浓度为5 μg/ml,并加入TAM使终浓度为10 μM,避光,37℃、5%CO2培养箱中分别染色30、60、120 min,在染色过程中加入PI染液使PI终浓度为1 μg/ml,避光染色30 min后离心收集细胞,以PBS洗涤并重悬,以流式细胞术检测未被PI着色细胞的胞内荧光值强度。 6. 流式细胞术检测细胞荧光值 取对数生长期细胞,制备成单细胞悬液,加入TAM使终浓度为10 μM,以hochest 33342和PI染色30 min后换液一次,让细胞继续在培养液中培养30、60、120 min后用流式细胞术检测未被PI着色细胞的胞内荧光值强度。 三、 统计处理 采用SPSS 10.0统计软件包进行t检验,P0.05为差异有显著意义。 结果 一、 gen公司测序 两株细胞的BCRP均没有482位氨基酸的突变(送invitrogen公司测序)。RT-PCR及Western blot分析显示两株细胞的BCRP在mRNA及蛋白水平上有表达差异,与JAR细胞相比,JAR/VP16细胞系BCRP的表达明显上调(图1)。 二、 tam对vp18的耐药性 两株细胞在加入TAM时均可增加VP16对细胞的毒性,对VP16耐药细胞株JAR/VP16,TAM可在一定程度上逆转其对VP16的耐药性(图2)。TAM浓度为6.25 μM和10 μM时对JAR和JAR/VP16细胞均无明显的细胞毒性作用,但与单用VP16组相比,TAM与VP16联合应用时可显著增加VP16对细胞的毒性作用。且这种作用在VP16为不同剂量时均有效,未观察到随着VP16浓度的增加,TAM的这种作用有所降低。 三、 不同时间点不同的药物在胞内的浓度不同 无论是JAR细胞还是JAR/VP16细胞,TAM均可使胞内的Hochest 33342荧光值强度增加(图3)。在药物的摄入过程模式中,随着时间的增加,药物在胞内的浓度也增加,但与对照组相比,TAM处理组可明显增加药物在胞内的浓度,减少外泵(0～120 min时间点)。而在药物的排出模式中,TAM处理组亦可明显增加药物在胞内的持续蓄积(180～240 min时间点)。 四、 tam对rpmrna的调节作用 以RT-PCR技术,观察到在处理48 h后VP16可以上调JAR/VP16细胞BCRP mRNA的水平,而TAM可以下调BCRP的表