不同交联方式对igafc受体介导的中性粒细胞脱颗粒行为的影响.docxVIP

不同交联方式对igafc受体介导的中性粒细胞脱颗粒行为的影响 iga通过与细胞表面的iga僵尸（icur）结合发挥作用。多种髓样细胞,如中性粒细胞、单核细胞、嗜酸性细胞都表达FcαR。现在已知FcαR在髓样细胞中可以介导多种细胞反应,如脱颗粒反应、呼吸爆发、吞噬反应、细胞因子的释放以及胞内Ca2+离子浓度的增加等。它也能够促进ADCC(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)的作用。据报道,游离的IgA可以与FcαR结合,但并不引起细胞活化,只有FcαR在交联状态下,如用单克隆抗体或是聚合的IgA ,才能引起细胞活化。FcαR在进行信号转导时需要靠其他膜蛋白或胞浆内蛋白的协助来完成。现已知FcαR在跨膜区域有一个带正电荷的精氨酸,它和FcRγ链的带负电荷的天冬氨酸靠静电吸引形成复合物,并通过γ-链进行信号转导。在FcRγ链存在的情况下,交联FcαR引起胞外钙离子的涌入和胞内酪氨酸磷酸化作用,在没有FcRγ链的情况下,交联FcαR不能引起细胞的活化。本文是我们对FcαR介导的中性粒细胞脱颗粒反应的研究结果。 中性细胞fcr的作用 主要试剂:胃蛋白酶、FITC交联的抗小鼠IgG、无钙镁HBSS干粉、无内毒素小牛血清白蛋白、MOPC-21、细胞松弛素B均由Sigma公司提供;Percoll分离液、Dextran T500、125I由Pharmacia公司提供;乳铁蛋白由Calbiochem公司提供;EGTA由AMRESCO公司提供;Iodogen由Pierce and Warriner公司提供;兔抗小鼠IgG、兔抗乳铁蛋白抗体、碱性磷酸酶标记的抗乳铁蛋白抗体由本室自制;MIP8a、可溶性FcαR、IgA交联的葡聚糖珠、NIP交联的小牛血清白蛋白(NIP-BSA)、抗NIP IgA抗体由英国剑桥大学分子免疫病理研究所提供。MIP8a腹水经蛋白A柱亲和层析纯化。MIP8a和兔抗小鼠IgG抗体经胰蛋白酶消化得F(ab)′2片段,未消化的抗体用蛋白A吸附除去。 中性粒细胞的分离:健康献血者新鲜外周血,肝素抗凝。在1%的Dextran T500和5mmol/L的EDTA中混匀,室温静置沉降30 min。上清液中的白细胞悬浮于HBSS中,加在不连续的Percoll分离液上(底层78% Percoll,上层54% Percoll),400×g离心30 min。离心后的中性粒细胞层用HBSS清洗2遍后再悬浮于HBSS中备用,悬浮液中所含中性粒细胞一般在95%以上。 MIP8a对中性粒细胞FcαR的结合作用:4×105个中性粒细胞悬浮在100μl清洗液(PBS,0.1%叠氮钠,1% BSA)中,加入不同浓度的MIP8a,冰浴30 min;清洗3遍后每管加入100μl 50倍稀释的FITC-抗小鼠IgG,再冰浴30 min。清洗3遍,用400μl 1%的多聚甲醛溶液固定后用流式细胞仪检测。MOPC-21为同型抗体阴性对照。 FcαR 对IgA的结合作用:可溶性FcαR用Iodogen法进行Na125I标记,标记后的产物过Sephadex G-25柱除去游离的Na125I。125I标记的可溶性FcαR中加入50μl IgA葡聚糖珠,室温置旋转混合器混和1 h。用2% BSA/HBSS清洗3次,在1277型γ计数仪(Pharmacia)上对葡聚糖珠进行放射性计数。 脱颗粒反应的测定:当IgA IC用于激活中性粒细胞时,抗NIP IgA(60μg/ml)与NIP-BSA先以最适浓度比在含有1.5mmol/L MgCl2和1mmol/L CaCl2的HBSS中混合,37℃孵育3 h。抗NIP IgA与NIP-BSA最适浓度比按文献所述方法确定。然后在96孔培养板中将50μl IgA IC加入100μl的中性粒细胞悬液(含4×105个细胞及7.5μg/ml的细胞松弛素B),在37℃反应至预定的时间。当MIP8a用于激活中性粒细胞时,25μl MIP8a F(ab)′2片段与100μl的中性粒细胞悬液混合,室温放置10 min,然后每孔加入25μl兔抗小鼠IgG F(ab)′2片段(120μg/ml),37℃反应至预定的时间。当MIP8a用于封闭中性粒细胞表面FcαR时,25μl MIP8a F(ab)′2片段先与100μl的中性粒细胞悬液混合,室温放置10 min,然后每孔加入25μl IgA IC(120μg/ml),37℃反应至预定的时间。 反应完毕,将中性粒细胞上清液与细胞离心分离。用双抗体夹心ELISA法检测上清液中乳铁蛋白的含量。96孔板用兔抗乳铁蛋白抗体包被,碱性磷酸酶标记的抗乳铁蛋白抗体作为第二抗体。由已知浓度的乳铁蛋白绘制标准曲线。实验数据各点均为3个平行孔的平均值加上标准差,每个实验至少重复