miR-891a-5p通过CPEB1调控结肠癌细胞生物过程的机制研究.docxVIP

? ? miR-891a-5p通过CPEB1调控结肠癌细胞生物过程的机制研究 ? ? 张新燕，赵国栋 结肠癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一。研究显示近年来结肠癌的发病率上升，发病年龄降低，对人类生命和健康构成严重威胁［1-2］。结肠癌在发病早期无特定症状，不易被发现。大多数患者在确诊时已至晚期，预后较差。转移性结肠癌患者的5年生存率远低于非转移性结肠癌患者［3-4］。寻找早期治疗结肠癌的潜在靶点具有重要意义。微小RNA（miRNA）是一种内源性保守的18～25个核苷酸组成的单链RNA分子，其可抑制mRNA的转录或蛋白翻译过程，调控蛋白的表达，参与人类多种癌症的发生发展过程［5-6］。miR-891a-5p 是新近发现的肿瘤相关miRNA，在黑色素瘤［7］中具有抑癌作用，在前列腺癌［8］中发挥促癌作用。细胞质多聚腺苷酸化元件结合蛋白（cytoplasmic polyadenylation element binding protein，CPEB）的抑癌功能已被证实［9］，但其与miR-891a-5p 间是否存在相互作用尚不明确。本研究拟通过观察miR-891a-5p 在结肠癌组织、细胞中的表达及其对结肠癌细胞存活、凋亡、迁移和侵袭的影响，揭示其作用机制与CPEB1 之间的关系，以期为结肠癌治疗提供理论支持。 1 材料与方法 1.1 标本来源 结肠癌组织及癌旁组织来自海口市人民医院2019年2月—2021年9月经结肠镜检查联合病理学活检诊断为结肠癌并接受手术切除的患者。排除标准：合并其他肿瘤者；预计存活时间小于3个月者；1个月内进行过外科手术者；可测量病灶不足2个者。共纳入79例，年龄38～67岁，平均（54±3）岁，男40例，女39例。所有患者及家属均签署知情同意书，本研究经本医院医学伦理委员会批准［院科伦审：（2019）伦审第（9号）］。 1.2 主要试剂及仪器 人正常结肠上皮细胞NCM460、人结肠癌细胞LOVO、SW480、HCT116均购自美国菌种保藏中心；DMEM 培养液购自美国Gibco 公司；胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；LipofectamineTM3000 转染试剂盒购自美国Promega 公司；TRIzol 液购自美国赛默飞世尔科技公司；实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（qPCR）试剂盒（Mir-X miRNA qRT-PCR）购自日本Takara公司；细胞计数试剂盒（CCK-8）购自日本同仁化学研究所；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自上海碧云天生物科技有限公司；兔抗人甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）单抗、兔抗人细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）多抗购自美国Cell Signaling Technology公司；兔抗人活化的胱天蛋白酶-3（C-caspase-3）单抗、兔抗人胱天蛋白酶-3 酶原（Pro-caspase-3）单抗购美国Bio Vision；兔抗人CPEB1多抗、兔抗人N-钙黏蛋白（N-cadherin）多抗、兔抗人上皮细胞钙黏蛋白（E-cadherin）多抗和兔抗人波形蛋白（Vimentin）多抗均购自美国Proteintech 公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔二抗购自美国赛默飞世尔科技公司；Transwell 小室购自美国Corning 公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国Biotium 公司；miR-con、miR-891a-5p、anti-miR-con、anti-miR-891a-5p、si-con、si-CPEB1序列及引物的设计、合成均委托上海吉玛基因股份有限公司完成。倒置显微镜购自日本Nikon 公司；凝胶成像系统、电泳仪、转膜仪购自美国Bio-Rad 公司；流式细胞仪购自美国赛默飞世尔科技公司。 1.2 方法 1.2.1 细胞培养 NCM460、LOVO、SW480、HCT116 细胞使用DMEM 培养液（含10%胎牛血清+1%青霉素-链霉素混合液）于37 ℃、5%CO2的饱和湿度恒温细胞培养箱中培养，每隔2 d更换1次新鲜培养液。 1.2.2 qPCR 检测miR-891a-5p 表达 TRIzol 液提取组织和细胞总RNA，并将其反转录为cDNA后进行PCR反应。20 μL反应体系，hsa-miR-891a-5p 引物上游5-GTGCAACGAACCTGAGC-3，下游5-GACCTGAACCTGAACCTGAA-3，产物大小22 bp；U6 引物上游5-CTCGCTTCGGCAGCACA-3，下游5-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3，产物大小13 bp。反应条件为：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火38 s，72 ℃延伸15 s，40 个循环。以U6 为内参，2-Δ