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双峰驼乳中igg的分离纯化及免疫活性测定
在干旱和半干旱地区,世界上大约有1580万骆驼。世界上许多地区的人把驼乳作为主要的饮食来源之一。据报道在良好饲养管理条件下一峰健康骆驼一个完整泌乳期内可产2000L驼乳。驼乳除了含有与牛乳一样的营养物质之外,还有比牛乳含量更丰富的生物活性成分,如溶菌酶、乳铁蛋白和免疫球蛋白等。大部分驼乳是以鲜奶或者以酸驼奶形式饮用,还可以经巴氏消毒、煮沸等灭菌方法处理,延长其保存期。但是上述处理方法对驼乳生物活性成分将带来不同程度地不利影响。热处理对于牛奶营养和活性成分的影响已加以广泛研究,但热处理对于驼乳的影响研究较少。本研究首次从内蒙古阿拉善双峰驼驼乳中分离纯化了IgG,并采用单向免疫扩散法测定了不同温度对驼乳IgG活性的影响,同时与牛乳IgG的热稳定性进行了比较研究,为驼乳的开发和商业化利用奠定提供试验依据。
1 材料和方法
1.1 材料表面
1.1.1 乳样
健康双峰母驼10峰,购自内蒙古阿拉善盟,属阿拉善双峰驼。分别挤奶后混合乳样,经高速离心脱脂后置-2 0℃冰柜保存。
1.1.2 生物有限责任公司
DEAE-52 Whatman进口分装;丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺中国医学科学院生物医学工程研究所;考马斯亮蓝R250(BS05221)华美生物有限责任公司;丙三醇(2004429)天津北宏试剂厂;Tris TBD生物有限责任公司,Roche分装;过硫酸胺TBD生物有限责任公司;标准分子量蛋白(14.4~97.4ku)中国科学院上海生化研究所。
1.2 方法
1.2.1 硫酸铵-pb法
将冷冻的脱脂初乳解冻并水浴至35℃后加凝乳酶,35℃保温凝乳。然后将凝乳破碎,于4800r/min离心20min,收集乳清。用等体积的0.01mol/L pH7.2的PB稀释乳清后缓慢加入饱和硫酸铵(在搅拌器中不断搅拌),使其饱和度达到40%,4℃放置4h,于4244r/min下,4℃离心15min,收集沉淀,并且将沉淀用0.01mol/L pH7.2的PB溶解至原始乳清体积,再进行第二次沉淀。将最终得到的沉淀用原乳清体积的0.01mol/L pH7.2的PB溶解,置透析袋中于4℃下对0.01mol/L pH7.2 PB透析,直到透析液中检测不到SO42-为止(用1%的BaCl2不断检测),然后冷冻干燥,即为I g G的粗提取物。
1.2.2 提取igg的制备
采用DEAE-52进行离子交换层析。将DEAE-52先用0.5mol/L的NaOH浸洗,再用去离子水洗至pH8左右,并用0.0175mol/L pH6.7 PB平衡后上柱,装柱规格1.7cm×30cm。取2.5g IgG的粗提取物溶于20ml 0.0175mol/L pH6.7 PB中,平衡后上样,用0.0175mol/L pH6.7 PB洗脱,待出现峰后进行收集。全部操作在4℃下进行,洗脱速度为60ml/h,280nm下自动检测并记录,将收集液冻干。
1.2.3 sds-gail,俄罗斯
采用SDS还原电泳,浓缩胶为3.0%,分离胶为15.0%,15mA恒流电泳4~5h。用考马斯亮蓝染色。
1.2.4 加强免疫方案
用弗氏完全佐剂乳化的驼Ig G(2mg/ml)皮下和肌肉多点注射的方法免疫家兔,每点0.5ml,10d后接着用弗氏不完全佐剂乳化的驼IgG(1mg/ml)皮下和肌肉多点注入进行加强免疫,每点0.5ml。第30d时,同上次的方法进行加强免疫,第44d时检测效价达到1:32,采血置4℃冰箱自然凝固,于3500r/min离心10min,分离血清置-2 0℃保存。
1.2.5 水浴加热处理
驼乳混合后,在4800r/min离心20min两次,去除脂肪。然后将乳样分成5等份。一份作为对照(未经热处理的驼乳),剩余的分别于65、75、85和100℃的水浴中加热30min,然后迅速降到35℃,然后在乳样中加凝乳酶于35℃保温凝乳。接着将凝乳破碎,于4800r/min离心2 0 m i n,收集乳清。
1.2.6 兔抗蚤
采用单向免疫扩散法测定驼乳IgG含量。首先用生理盐水配成1.5%琼脂,沸水浴溶化后,恒温于56℃水浴中备用。将兔抗驼IgG抗血清用生理盐水做10倍稀释,再与1.5%琼脂溶液等量混合,趁热浇于培养皿中,等完全凝固后打直径为3mm的小孔。待测样品稀释成不同稀释度,每孔加入10μl。将加好样的培养皿放入湿盒中,37℃温育24h后,取出,用精密度为0.02mm的游标卡尺测其沉淀环直径,求平均值,并根据标准曲线计算出IgG含量。
2 结果与分析
2.1 样品的纯化和回收率
用40%饱和硫酸铵对乳清进行两次沉淀后,IgG粗提取物中IgG占蛋白含量的57.9%。再经离子交换层析柱纯化后收集的样品中IgG占蛋白含量的95.5%。最终回收率为17.1%(表1)
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