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固相萃取结合超高效液相色谱-串联质谱法测定冻干鱼粉中恩诺沙星和环丙沙星残留量
恩诺沙星和环丙沙星属于赫诺酮类药物（quinolos，qns）。由于其强抗菌性、抗菌谱广、效率高、低毒、组织渗透性和低价格，已成为医学诊断和水产养殖中的一种重要抗感染药物。但是,动物用药后的药物残留可以通过食物链传递,会引起人体不良反应,影响人体健康。因此,对动物体内喹诺酮类药物残留量的检测已越来越受到人们的关注。目前常见的喹诺酮残留检测方法主要有酶联免疫法、高效毛细管电泳法、液相色谱法和液相色谱-串联质谱法[9,10,11,12,13,14]。本实验采用固相萃取和液液萃取两种方法对样品进行前处理,以超高效液相色谱-串联质谱测定,比较了两种前处理方法的测定结果和优缺点,为水产品及其制品中恩诺沙星和环丙沙星残留检测提供参考。
1 材料和方法
1.1 主要试剂与仪器
鲤鱼鲜鱼2000g,放血、去鳞、去内脏、去皮,取背部肌肉搅碎;冻干鲤鱼粉威海出入境检验检疫局。
乙腈、甲醇、正己烷、甲酸(均为色谱纯)美国F i s h e r公司;柠檬酸、磷酸氢二钠、乙二胺四乙酸二钠(均为分析纯)国药集团化学试剂公司;环丙沙星(纯度94.0%)、恩诺沙星(纯度99.0%)德国Dr Ehrenstofer公司;水为Milli-Q超纯水;Oasis HLB 6mL/200mg固相萃取小柱美国Waters公司。OR
AcQuityTM-TQD超高效液相色谱-串联质谱仪美国Waters公司;MTN-2800氮吹仪天津奥特赛恩斯公司;R-210旋转蒸发仪Buchi公司;KQ5200B型超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司;Allegra 64 R离心机Beckman Coulter公司;CP224S电子分析天平Sart o ri u s公司。
1.2 缓冲溶液配制
分别准确称取适量恩诺沙星和环丙沙星标准品,用乙腈溶液配制成0.2mg/mL的标准储备液,-18℃避光保存。
Mcllvaine缓冲溶液:将1000mL 0.1mol/L柠檬酸溶液与625mL 0.2mol/L磷酸氢二钠溶液混合,必要时用盐酸或氢氧化钠调节p H值至4.00±0.05;EDTA-Mcllvaine缓冲溶液:称取60.5g乙二胺四乙酸二钠放入1625mL M c ll v a in e缓冲溶液中,振摇使其溶解。
1.3 试验条件
1.3.1 流动相lma
色谱柱:Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱(50mm×2.1mm,1.7μm);流速:0.2mL/min;柱温:35℃;进样体积:10μL。流动相:A为甲醇-乙腈溶液40:60(V/V),B为体积分数为0.2%甲酸溶液;梯度洗脱条件见表1。OR
1.3.2 离子源温度u
电离模式:电喷雾电离正离子模式(ESI+);检测方式:多反应监测(MRM);毛细管电压:1.2k V;透镜电压:0.1 V;离子源温度:12 0℃;脱溶剂气温度:3 5 0℃;脱溶剂气流量:6 5 0 L/h。定性离子对、定量离子对、锥孔电压及碰撞能量见表2。
1.4 固相萃取法
1.4.1 超声提取法
称取试样0.5g(精确至0.1mg),置于50mL聚四氟乙烯离心管中,加入2.5g水,摇匀,静置10min,然后加入20mL 0.1mol/L EDTA-Mcllvaine缓冲溶液,用均质器均质1min,超声提取10min,5℃条件下10000r/min离心5min。
1.4.2 淋洗脱液和洗脱液的制备
分别用6mL甲醇洗涤、6mL水活化HLB固相萃取柱,取4mL提取液以2～3mL/min的速度过柱,弃去滤液,用2m L 5%甲醇溶液淋洗,弃去淋洗液,将小柱抽干,再用6m L甲醇洗脱并收集洗脱液。洗脱液用氮气吹干后,用1mL乙腈-体积分数0.2%甲酸溶液(体积比1:9)溶解,涡旋混合1min,0.22μm滤膜过滤,待超高效液相色谱-串联质谱仪测定。
1.4.3 标准溶液的配制
移取一定体积的标准储备液,用初始流动相稀释成1.0μg/mL质量浓度的混合标准溶液。取阴性样品5份,依次加入一定量的混合标准溶液,按照以上方法处理,得到质量浓度分别为2、5、10、30、60ng/mL的系列标准溶液。
1.5 萃取液的方法
1.5.1 氟乙烯离心管的制备
称取试样0.5g(精确至0.1mg),置于50mL聚四氟乙烯离心管中,加入2.5g水,摇匀,静置10min,然后加入20mL 2%的甲酸-乙腈溶液,用均质器均质1min,超声提取10min,4000r/min离心5min。
1.5.2 鸡心瓶和鸡心瓶蒸发
将上清液转移到预先加有25mL乙腈饱和的正己烷的分液漏斗中,充分振荡、静止分层,弃去上层溶液,将下层溶液取4mL转移至50mL鸡心瓶中,于40℃水浴中旋转蒸发干。用1mL乙腈-体
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