响应面法优化米曲霉固体发酵产果胶酶条件.docxVIP

响应面法优化米曲霉固体发酵产果胶酶条件 果胶是一种天然的高纯度糖聚合物，其主链由不同的异构化度半醇酸-1和4-糖苷键组成。果实糖酶是一种重要的分解果胶物质的酶，它可以分解各种果胶物质。内切酶-1和4-糖苷键是果胶的主要成分。它可以广泛应用于食品行业的低聚糖糖。果汁、果酒、果味酒、天然产物提取、生物血浆和饲料。它是世界四大工业酶之一。 果胶经内切聚半乳糖醛酸酶特异性水解所得产物为聚合度不等的果胶低聚糖(POS,DP:2-10),POS是公认的功能性食品添加剂,其重要的生理功能主要表现在:能特异性增殖双歧杆菌和乳酸菌;保护HT29大肠细胞不受大肠杆菌O157∶H7分泌的vero毒素(VT)的侵袭,显著提高HT29大肠细胞的存活率;POS还具有抗氧化、肠道免疫活性以及降低血糖等生理功能;POS生产原料为价廉易得的橘皮果胶,生产成本易于控制,应用前景非常广泛.选育优良的内切型聚半乳糖醛酸酶生产菌株并对其发酵条件进行优化,有助于获得适用于制备果胶低聚糖的专用果胶酶,降低果胶酶生产、应用成本. 我国是世界上主要的柑橘生产国,橘皮作为柑橘加工业的副产品产量巨大,是微生物固体发酵的良好基质,而其含的果胶可作为果胶酶生物合成的诱导物.利用廉价易得的橘皮为原料,固体发酵生产高效果胶酶不但能降低果胶酶工业生产成本,而且可为酶法制备高品质果胶低聚糖奠定基础,同时也可提高柑橘加工副产物橘皮和残次柑橘的综合利用率,拉长柑橘产业链条,提高橘农收入,服务于循环经济.本研究以麸皮和橘皮为固体发酵基质,采用响应面法(一)(RSM)中的中心组合设计法(CCD)对影响米曲霉产果胶酶的固体发酵条件进行了优化,并系统研究了果胶酶的酶学性质. 1 材料和方法 1.1 样品采集和分析 产果胶酶菌种米曲霉(Aspergillus oryzaeJL14)由本实验室从杭州植物园土样中分离,保存于PDA斜面上.果胶和牛血清白蛋白(BSA)购自Sigma,D-(+)-半乳糖醛酸购自Fluka,蛋白胨和酵母膏购自Difco,其它试剂为国产分析纯. 1.2 橘皮提取物的制备 米曲霉固体发酵产果胶酶的基础培养基为:麸皮(98%,以干物质计,下同),MgSO4(0.05%),K2HPO4(0.15%),含水量为65%,30℃恒温培养.通过单因素实验,研究添加橘皮粉、氮源,发酵初始含水量和发酵时间对米曲霉产果胶酶的影响. 1.3 响应面拟和分析 采用二次回归正交旋转组合设计模型,以橘皮粉浓度、氮源浓度、初始含水量和发酵时间为自变量,分别用X1、X2、X3和X4来表示,按方程xi=(Xi-X0)/△X对自变量进行编码(表1),式中,xi为自变量的编码值,Xi为自变量的真实值,X0为实验中心点出自变量的真实值,△X为自变量的变化步长,果胶酶产量Y为响应值.采用SAS 9.0对实验数据进行回归拟和并对拟和方程作显著性检验及方差分析,利用Matlab 6.5作响应面和等值线图. 1.4 蛋白质浓度测定 果胶酶活性测定采用DNS法,果胶酶活力单位(U)定义为:在最适反应条件下,以每1 min生成1 μmol还原糖(以D-半乳糖醛酸计)所需的酶量作为一个酶活力单位.蛋白质浓度的测定采用Bradford法.酶促动力学常数最大反应速度(Vmax)、米氏常数(Km)测定采用双倒数作图法. 1.5 残余酶活的测定 测定果胶酶在30～80 ℃下的活性,以确定其最适温度.果胶酶在30～80 ℃下分别保温4 min,然后冰浴5 min,在最适条件下测定酶活,以未经热处理的果胶酶在最适条件下的酶活为对照,计算残余酶活,并计算其Tm值. 1.6 ph对残余酶活性的影响 果胶底物分别用pH 3.0～9.0的缓冲液配制,测定果胶酶活性,确定其最适pH.将果胶酶液pH分别调为pH3.0～9.0,在25 ℃条件下保温1 h,然后在最适条件下(50 ℃、pH 4.0)测定酶活,计算残余酶活. 1.7 金属离子的初始浓度对果胶酶残余酶活性的影响 分别向果胶酶中添加CaCl2、MgSO4、CuSO4、ZnSO4、MnSO4、FeCl3、KCl、AlCl3和CoCl2,各种金属离子的终浓度均为5.0 mmol/L,在25 ℃下处理1 h,计算果胶酶残余酶活. 1.8 还原糖浓度测定 以250 mL 4.0%的果胶为底物,添加400 U酶液,在28 ℃下反应,采用DV-I Prime(Brookfield)黏度计测定反应体系的黏度变化,选用S-02号转子,100 r/min转速,每间隔5 min取样测定还原糖浓度. 2 结果与分析 2.1 果胶酶产量测定 以基础培养果胶酶产量为对照,分别研究了添加橘皮粉(10%、20%、50%、75%和100%),氮源(硫酸铵、氯化铵、蛋白胨、玉米浆粉和酵母膏)、固体发酵初始含水量(50%、55%、60%