凝胶迁移或电泳迁移率实验.docxVIP

凝胶迁移或电泳迁移率EMSA实验一：介绍凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA—electrophoreticmobilityshiftassay）是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究DNA结合蛋白，目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用.通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，分离复合物和非结合的探针。DNA-复合物或RNA—复合物比非结合的探针移动得慢.同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同，可是双链或者是单链。当检测如转录调控因子一类的DNA结合蛋白，可用纯化蛋白，部分纯化蛋白，或核细胞抽提液。在检测RNA结合蛋白时，依据目的RNA结合蛋白的位置，可用纯化或部分纯化的蛋白，也可用核或胞质细胞抽提液。竞争实验中采用含蛋白结合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段（特异），和其它非相关的片段（非特异），来确定DNA或RNA结合蛋白的特异性.在竞争的特异和非特异片段的存在下，依据复合物的特点和强度来确定特异结合。【晶莱生物】二：实验步骤探针的标记探针为含有与蛋白特异结合的中心盒，大约20bp左右，使用pierce公司的3’末端标记试剂盒（PIERCE，Rockford，IL,USA）标记。操作步骤参照说明书，具体步骤如下： 1）将试剂盒中除TdT以外的其他组分解冻并置于冰上。迅速稀释TdT：SxTdTReactionBuffer2u1,超纯水7ul20U/ulTdT1ul。稀释后得到1XdilutedTdT（2U/ul），稀释后的TdT必须现配现用，稀释后不能保存。 2）反应体系：5xTdTbuffer10ul，DNA5pmol，Biotin-ll-UTP5ul，dilutedTdT5ul，超纯水补足50ul。在37°C温浴30min，加入2/5体积0。2MEDTA，终止反应。加入等体积氯0仿：异戊醇（24：1）抽提TdT，涡悬充分，高速离心3min，取上层即为标记探针，分装后-80C保存。 2。非变性电泳 1）非变性电泳:30%丙稀酸胺2。66ml，TBE（5X）2ml，10%过硫酸按1.4ml,TEMED7ul，双蒸水补足20ml。按照上述配方配置4%的非变性胶.在烧杯中迅速混匀，置于冰上，灌胶，待凝胶聚合后拔出梳子，用双蒸水洗点样孔，再用0。5xTBE清洗点样孔. 2）样品准备：按照不同的组合加入DNA和蛋白，另外还需要加入结合缓冲液，如果是粗蛋白还需要加入poly（dI.dC）（试剂盒中有）抑制非特异性条带的产生。 3）电泳：预跑胶30-60min，100V。上样。跑胶，100V，30min左右。注意电泳要在冰上完成，以防止电泳时产生热量使不稳定的复合物解离. 4）转膜：电泳跑好后，将胶取下，放在大小相似的尼龙膜上，上下各加一层润湿的blottingpaper，放到半干转移装置上，100V，380mA，转膜1h。 5）UV交联：取出膜。在紫外交联仪中999。9mJ，固定10min。 6）洗膜: a。将BlockingBuffer和4XWashBuffer置于37—50C使其溶解。 用20mlofBlockingBuffer封闭膜，温浴15min,摇床轻摇。 在20mlBlockingBuffer中加入66。7ulStabilizedStreptavidin-HorseradishPeroxidaseConjugate（1:300稀释），配置成conjugate/blockingsolution. do将膜从blockingbuffer中取出，在conjugate/blockingsolution中轻摇15min。 e。将4XWashBuffer用双蒸水稀释成1Xwashsolution。 将膜置于新的培养皿，用20ml1Xwashsolution冲洗。 用1Xwashsolution洗膜4次，每次5min，摇床轻摇。 h。在新培养皿中加入30mlSubstrateEquilibrationBuffer,将膜放入，温浴5min，摇床轻摇。 io将6mlLuminol/EnhancerSolution和6mlStablePeroxideSolution避光置于锡箔纸包好的烧杯中，摇匀，作为SubstrateWorkingSolution。 j.将膜从SubstrateEquilibrationBuffer中取出，用滤纸尽量吸去液体，放入新的培养皿。 k.将SubstrateWorkingSolution用枪慢慢加到膜上使液体尽量到达整张膜，静置5min。 取出膜，控制膜不能干燥。 mo用保鲜膜将膜包好，不能有气泡。 n.在暗室中，将膜放入曝光盒，用X—ray胶片压片，曝光时间随