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骨骼肌murf1基因表达与运动 废除性肌腱痉挛是指在运动受限、运动减少或身体重量丧失的情况下，肌肉骨骼的形态、生理、生化和功能变化主要表现为肌肉重量减轻、肌肉纤维横截面积缩小、z线中断、肌肉原纤维溶解、肌肉收缩力降低等。临床上许多疾病 (如瘫痪、肿瘤、烧伤、运动创伤) 或各种治疗措施 (如骨折固定等) 常常伴有运动减退甚至要求制动, 极易诱发废用性骨骼肌萎缩;而宇航员长时间在失重条件下工作同样也面临肌肉萎缩这一问题的困扰。废用性肌萎缩的发生机制和治疗已经成为是临床医学、运动医学、康复医学及航天医学等领域的研究热点之一。目前的研究认为泛素蛋白酶体系统在废用性肌萎缩的发生发展过程具有重要功能, 也是废用性肌萎缩治疗的重要靶点。MuRF1 (Muscle ring finger 1) 是近年来发现的肌肉特异表达的泛素蛋白连接酶, 主要在骨骼肌、心肌中表达, 是骨骼肌萎缩重要的调节因子, 然而其在废用性肌萎缩中表达及运动对其表达的调节作用尚不清楚。因此, 本研究拟通过鼠尾悬吊建立废用性骨骼肌萎缩大鼠模型, 研究废用状态以及运动训练对骨骼肌MuRF1表达的调节作用。 1 材料和方法 1.1 鼠尾悬吊治疗 3月龄雄性SD大鼠30只, 随机分成4组, 分别为 (1) 正常对照组:大鼠自由活动及饮食饮水; (2) 鼠尾悬吊组:大鼠行鼠尾悬吊4周, 自由饮食饮水; (3) 鼠尾悬吊后自然恢复组:大鼠行鼠尾悬吊4周后, 解除悬吊, 自由活动5周, 大鼠自由饮食饮水; (4) 鼠尾悬吊后运动恢复组:大鼠行鼠尾悬吊4周后, 解除悬吊, 经1周适应性活动后有氧运动4周, 大鼠自由饮食饮水。 1.2 大鼠悬吊及游泳训练 除正常对照组外, 其余大鼠均进行鼠尾悬吊法制备废用性骨骼肌萎缩模型。鼠尾悬吊采用自制的鼠尾夹固定鼠尾, 悬吊于自制的饲养笼内, 悬吊高度以大鼠后肢不能着地为准。鼠尾悬吊期间, 每日检查鼠尾固定的部位, 对固定脱落或者因固定导致的淤血等随时予以调整。自然恢复组大鼠悬吊4周后, 解除悬吊, 饲养笼内自由活动恢复5周;运动恢复组大鼠解除悬吊后饲养笼内适应性活动1周后进行游泳训练, 每周训练5次, 每天1次。训练第1周游泳时间为30 min/d, 以后每周递增20 min, 至训练第4周时训练时间增加至90 min/d。游泳池水深0.5 m, 水温保持在35℃～37℃。 1.3 肌纤维横截面积 各组大鼠经3%戊巴比妥钠 (30 mg/kg体重) 腹腔麻醉后取双侧腓肠肌段。 腓肠肌经4%多聚甲醛固定后制作8 μm石蜡切片, HE染色。使用Image Pro plus 图像采集系统进行图像采集及分析, 计算肌纤维横截面积。每只动物随机选取5张切片, 每个切片观察5这个视野, 计算平均值。 1.4 脂质过氧化产物的检测 各组大鼠腓肠肌组织经匀浆后采用羟胺法测定超氧化物歧化酶 (SOD) 活性;骨骼肌细胞脂质过氧化水平通过硫代巴比妥酸法检测脂质过氧化产物丙二醛 (MDA) 来判断。蛋白定量通过双缩脲法进行。检测所用试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。 1.5 免疫组织化学 各组大鼠腓肠肌经4%多聚甲醛固定后, 常规石蜡包埋, 制作8μm石蜡切片, 用于MuRF1免疫组织化学染色。免疫组织化学染色采用SABC法 (博士德, 武汉) , 一抗MuRF1 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., 美国) 浓度为1∶500;阴性对照以PBS缓冲液替代一抗。DAB显色后苏木素复染。Olympus显微镜观察实验结果。 1.6 半定量pcr反应 取各组大鼠腓肠肌组织适量, 液氮预冷后碾磨, TRIzol (Invitrogen, 美国) 抽提总RNA。紫外分光光度计测量RNA浓度, 采用逆转录试剂盒 (MBI Fermentas, 立陶宛) 进行逆转录后进行半定量PCR反应。MuRF1引物序列为:5′-GTGAAGTTGCCCCCTTACAA-3′;5′-TGGAGATGCAATTGCTCAGT-3′。内参GAPDH引物序列为:5′-TGCACCACCAACTGCTTA-3′;5′-GGATGCAGGGATGATGTTC-3′。PCR扩增反应条件为: 94℃变性5min, 94℃ 30s, 56℃ 30s, 72℃延伸5min, 共进行30个循环。PCR产物采用1.5%琼脂糖凝胶电泳, 凝胶成像系统分析各目的条带积分光密度值, 每个标本重复3次。以MuRF1/GAPDH积分光密度值的比值衡量基因表达水平的变化。 1.7 数据处理与统计分析 实验数据以mean±SD表示, 各组数据采用单因素方差分析进行统计分析, 统计软件采用SPSS11.0软件包。 2 结果 2.1 小鼠腓肠肌生化检测 组织学分析结果表明, 鼠尾悬吊4周后, 腓肠肌肌纤维横截