骨骼肌废用状态及再负荷对大鼠肌钙蛋白酶活性和细胞膜通透性的影响.docxVIP

骨骼肌废用状态及再负荷对大鼠肌钙蛋白酶活性和细胞膜通透性的影响 在废弃（不活跃、睡眠不良、航空航天等）状态下大约2周，骨脂肌腱就会有显著的萎缩。萎缩的骨骼肌不仅收缩张力下降、疲劳性增加,在再负荷时还会导致骨骼肌损伤,从而严重影响骨骼肌的再适应能力,威胁航天员的航天飞行安全,增加航天员返回地面时的受伤风险。相关研究表明,废用引起的肌纤维横截面积的减小和收缩蛋白的丢失是肌肉收缩功能下降的主要原因,但骨骼肌收缩蛋白的减少机制以及萎缩骨骼肌再负荷引发的骨骼肌损伤机制远未明了。 钙蛋白酶(calpain)是存在于胞质中的Ca2+依赖性的半胱氨酸蛋白水解酶,参与肌肉生长与分化、细胞周期调控和凋亡等重要生理过程,近年的相关研究还发现钙蛋白酶与废用性肌萎缩的发生有关。肌肉萎缩会引起肌肉运动能力的下降,其中一个重要的因素是蛋白质合成减少和降解能力增强。泛素-蛋白酶体是废用状态下收缩蛋白降解的主要途径,但是,它不能降解完整的肌原纤维,而是首先激活calpain以降解膜骨架蛋白,使肌原纤维从细胞骨架上脱落,从而完成蛋白降解,故可认为calpain是废用状态下骨骼肌蛋白降解的启动子。大鼠后肢去负荷2周后,骨骼肌出现明显萎缩,肌细胞内钙离子水平明显上升,细胞内钙水平的升高会促使calpain转移至细胞膜上并激活,释放出具有活性的催化亚单位,启动并降解细胞骨架蛋白,如desmin、肌钙蛋白等,继而启动泛素-蛋白酶体的蛋白水解途径,造成肌纤维的损伤。有研究表明大鼠在经历14 d模拟失重后的再负荷会产生离心样损伤,如骨架蛋白降解、Z线结构破坏、过度扭曲等,但具体机制尚不明了。细胞膜通透性的异常改变是细胞微损伤的标志之一,故本实验以骨骼肌细胞膜通透性与calpian活性为主要指标,探讨废用状态及废用后再负荷对大鼠比目鱼肌的影响及骨骼肌的损伤机制。 材料和方法 1 实验分组与分组 健康SD雌性大鼠,7周龄,体重210～230 g(西安交通大学医学院实验动物中心提供,陕动字第08-005号),自由饮食饮水。分组前对大鼠进行跑台能力测试,剔除不能适应跑台运动的个体。按体重配对原则将48只合格大鼠随机分为4组,正常对照组(control,CON)、正常运动组(CON+training,CON+T)、吊尾2周组(tail-suspension,TS)和吊尾2周后强迫运动组(TS+T),每组12只,6只用于膜通透性实验,6只用于钙蛋白酶活性测定。吊尾组采用尾部悬吊法建立大鼠后肢骨骼肌废用模型。运动组利用动物跑台强迫大鼠运动,将大鼠置于跑台上,通过电刺激和声刺激驱使大鼠运动,跑台速度设置为16 m/min,跑3次,每次10 min, 间歇5 min。 2 悬吊笼制作 大鼠尾部悬吊14 d, 在干净及干燥的尾部表面喷涂安息酊和松香酊,并吹干,用医用胶布粘贴于大鼠干净尾部的后半部, 固定尾部, 胶布另一头连接在悬吊笼顶部可360°旋转的转接环上, 保持大鼠身体与水平面呈30°, 前肢着地自由活动, 自由饮食饮水。大鼠单笼饲养, 悬吊笼宽30 cm,长35 cm,高45 cm, 四壁为有机玻璃。饲养室室温20～25 ℃, 人工控制室内照明, 每昼夜均保持12 h光照与黑暗的循环交替。 3 垂直电泳槽和hz65-z动物跑台 伊文思蓝(Evans blue,EB)和casein(Sigma);Mini-PROTEAN垂直电泳槽(Bio-Rad);DMI6000B倒置荧光显微镜及拍摄装置、CM1850恒冷冰冻切片机(Leica);UV2550紫外分光光度计(岛津);HZ66-Z动物跑台(北京中西远大有限公司);考马斯亮蓝法试剂盒(南京建成生物研究所)。 4 测试指标 4.1 大腿骨横截面积csa和肝体重比的测量 在进行后续实验前用电子天平对取出的比目鱼肌称重,图像分析仪测量比目鱼肌切片图像中单根肌纤维的横截面积。 4.2 比目鱼肌的制备 大鼠称重后,用45 mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射进行麻醉,然后通过颈静脉插管注射3% EB荧光染液,待EB在大鼠体内循环2 h后取大鼠后肢比目鱼肌,称重,然后剪成4 mm×4 mm×4 mm的肌肉小块,置于液氮预冷过的异戊烷内冷冻,然后用OCT包埋剂包埋,放入冷冻切片机内准备切片。 将OCT包埋的肌肉样品连续切片,厚度为4μm,选择比较好的切片粘贴到浸泡过多聚赖氨酸的载玻片上,使切片完全展开,然后放在冷丙酮中固定5～10 min,中性树胶封片。在倒置荧光显微镜下以绿色激发光观察、拍照,每个样本进行多个视野测量,观察EB在肌肉组织中的分布。 4.3 calpa1活性的检测 用相同方法将大鼠麻醉,取大鼠一侧后肢比目鱼肌,以1 g∶40 mL的比例加匀浆缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl, 5 mmol/L EDTA, 1 mmol/L EGTA