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二氢杨梅素对几种食品微生物的抑菌效果 微生物污染是影响食品和安全的主要因素之一。据估计，世界上大约10%或20%的食品损失在腐败后。添加食品洗涤剂仍然是防止食品腐败和恶化质量的重要手段之一。目前普遍使用的化学防腐剂存在一定的安全隐患。天然防腐剂是从植物、动物、微生物代谢产物提取的抗菌活性物质,具有广谱、高效、低毒等化学防腐剂无法比拟的优点,因而越来越受到人们的青睐,已成为天然产物开发和食品加工研究领域的热点。显齿蛇葡萄俗称藤茶,是葡萄科蛇葡萄属的一种野生木质落叶藤本植物。不少学者对藤茶的化学成分进行了较深入的研究,证实藤茶的主要成分为二氢杨梅素。二氢杨梅素具有很强的氧化能力,能有效抑制细菌等微生物的生长。以往的研究多集中在藤茶和二氢杨梅素的药理药效等功能方面,本研究较深入地探讨了二氢杨梅素对常见的食品腐败菌的抑菌活性及其作用条件,旨在探讨藤茶提取物二氢杨梅素作为天然食品防腐剂的可能性。 1 材料和方法 1.1 实验材料 1.1.1 样品 1.1.2 不同病原菌的引起对酵母菌种的认识 湖南农业大学微生物实验室提供,其中细菌有大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、溶血性链球菌(Hemolytic treptococcus),霉菌有青霉(Penicillium sp)、黑曲霉(Aspergillus niger),酵母有啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。 1.2 实验方法 1.2.1 准备圆形滤纸 将滤纸片用滤纸打孔器制成直径为6.5 mm圆形小滤纸片,高温蒸气杀菌后烘干备用。 1.2.2 原料、消毒和样品制备 实验中的细菌培养基和真菌培养基的制备、灭菌及平皿制备均参考文献中方法进行。 1.2.3 供试菌的制备 细菌、酵母菌、霉菌悬液的制备:用接种环分别挑取3~4环培养1 d的各供试菌于带玻璃珠的装有90 m L无菌生理盐水(0.85%)的三角瓶内,振荡均匀,制成菌悬液。用稀释平板记数法和血球记数板测定菌数,调整菌悬液浓度,使其菌悬液浓度为106~107cfu/m L,现配现用。 1.2.4 抑菌圈直径测定 将样品用76%乙醇溶解,配成质量浓度分别为7.04、10.56、13.20g/L的二氢杨梅素乙醇溶液,倾少量于已灭菌的瓶内。将已灭菌烘干的圆滤纸片浸入不同浓度的溶液中6~8 h后,用无菌镊子夹出,贴于含菌平皿中。一个平皿贴3片含样品药液的滤纸片,呈正三角形。平皿中间贴一个用76%乙醇浸泡同样长时间的滤纸片,作为对照。将加好药液的平皿置恒温培养箱中培养,细菌于37℃培养24 h,酵母、霉菌于28℃培养48h,取出观察,测定抑菌圈直径。重复3次。 1.2.5 最低抑菌浓度测定 按文献介绍的试管2倍稀释法进行。具体操作是:取6支试管,于每一支试管内加入培养液2 m L(灭菌121℃,30 min)。吸取2 m L药液(二氢杨梅素浓度为7.04g/L)到第1管内,充分混匀后吸出2 m L到第2管中,依次稀释到第6管。第6管充分混匀后吸出2 m L混合液丢弃。再向每一管内分别加菌悬液0.05 m L(菌液浓度106~107cfu/m L)摇匀后细菌置37℃培养24 h取出观察。以能抑制细菌生长繁殖的药液最高稀释度为该药的最低抑菌浓度。将上述稀释度在MIC以前(包括MIC)的各菌药混合管取0.1 m L转接于琼脂平板上,用无菌玻璃刮铲涂抹均匀后,细菌于37℃培养24 h,酵母、霉菌于28℃培养48 h,取出观察结果,以仍没菌生长的最高药物稀释度为该药的最低杀菌浓度,重复3次。 1.2.6 不同ph下二氢杨树叶片的抑菌效果 将质量浓度为10.56 g/L二氢杨梅素用氢氧化钠和盐酸调成6个pH梯度(3~4、4~5、5~6、6~7、7~8、8~9),用上述1.2.4介绍的方法做抑菌圈的测定,观察不同pH下二氢杨梅素抑菌效果的变化,重复3次。 1.2.7 温度对二氢杨树莓原汁抑菌活性的影响 将二氢杨梅素用76%乙醇稀释成质量浓度为10.56 g/L的药液,药液121℃处理10 min,用上述1.2.4介绍的方法观察温度对二氢杨梅素抑菌活性的影响,重复3次。 2 结果与分析 2.1 不同菌种的抑制作用 本研究的结果显示,不同质量浓度的二氢杨梅素对供试的霉菌和酵母无明显的抑制作用,而对各种供试的细菌,无论是球菌和杆菌,革兰阴性菌和革兰阳性菌,都有明显的抑制效果,结果见表1。 2.2 抑菌浓度的测定 由表2可知,二氢杨梅素对各种供试细菌具有较低的抑菌浓度,对枯草芽孢杆菌和链球菌的最低抑菌浓度为1.74 g/L,对大肠杆菌的最低抑菌浓度为0.22 g/L,而对金黄色葡萄球菌的抑菌浓度更低,小于0.11 g/