京尼平交联明胶材料的特性研究.docxVIP

京尼平交联明胶材料的特性研究 1 低毒性交联剂 由于其良好的生物兼容性和可分解性，明胶在医药领域得到了广泛的应用。但是,因为体温下水溶性好、体内降解快,经常要交联后使用。常用的交联剂一般都有相当强的毒性,如戊二醛,所以寻找新的低毒性交联剂成为一个研究方向。 京尼平是近年来开始研究的一种交联剂,可用其交联明胶、胶原等材料,是传统中药杜仲的活性成分之一,其最大优点在于毒性很低。国内尚鲜有关于京尼平作为交联剂的报道,国际上也缺乏详细的京尼平交联明胶特性随交联时间变化的报道,所以本实验研究了京尼平交联明胶的交联度、细胞毒性、溶胀度和降解率等特性随交联时间变化的情况。 2 材料和方法 2.1 分光光度计和mtt 明胶(BIO BASIC INC生产);京尼平(日本和光纯药工业株式会社生产);茚三酮(购自Sigma公司);分光光度计(Unico WFZ UV-2100 spectrophotometer, Shanghai, China);MTT(购自Sigma公司)。Multiskan Mk3酶标仪(上海Thermo生产) 2.2 京尼平的制备 材料分为7组,即交联10 min、30 min、1 h、2 h、12 h、24 h、72 h组。10 mg明胶放入2 ml离心管内,在100℃水浴中加热1 h,对明胶及离心管进行消毒,再冷却至40℃,然后加入20 μl无菌的京尼平溶液(含京尼平0.3 mg),使京尼平在材料中的质量百分比为1%,交联10 min、30 min、1 h、2 h、12 h、24 h、72 h后,得到相应组材料。制作过程注意无菌操作。 2.3 材料检测方法 2.3.1 样品的制备和标准曲线的绘制 交联度反映明胶中与交联剂反应的氨基酸占总氨基酸数量的百分比,其值越高说明反应越完全,是反映明胶交联程度的重要指标。参照Yao等的方法,交联度测定采用茚三酮法。茚三酮法被广泛用于蛋白质交联度的检测,它可与样本中的自由α-氨基酸反应生成蓝紫色的色素,色素多少与自由α-氨基酸的量成正比。具体方法如下:①1.05 g的柠檬酸(citric acid)和10 ml(1.0 M)的NaOH和0.04 g的氯化亚锡(SnCl2·2H2O)混合,加去离子水调至25 ml,另将1 g的茚三酮(ninhydrin)加入25 ml 乙二醇甲醚(ethylene glycol monomethyl ether)中,再将上述两液体混合搅拌45 min,制成茚三酮溶液,存于黑瓶中备用。②京尼平交联明胶材料以及未加京尼平的等量明胶放入300 μl去离子水中,同时设置空白对照,静置60 min,再加3 ml茚三酮溶液,100℃加热20 min。③冷却至室温,加15 ml异丙醇(isopropyl glycohol),用分光光度计在570 nm下测量吸光度。④用5 μmol/ml的甘氨酸溶液做标准曲线,并通过此标准曲线查找各样本中自由α-氨基酸的摩尔数。所有反应在暗室进行。以M明胶组表示未加京尼平的等量明胶中含自由α-氨基酸摩尔数,M样品组表示各组样品中氨基酸摩尔数,按以下公式计算各组材料的交联度: CI=(M明胶组-M样品组)/M明胶组×100% 2.3.2 材料wo 溶胀度反映材料吸水膨胀的性能,降解率反映材料抗水解能力。各组受试材料各10个无菌条件下称重(Wo),然后加2 ml PBS溶液。24 h后取出,用消毒过的滤纸擦干水分后称重(W1)。溶胀率=(W1-Wo)/Wo×100%。将材料放回离心管中封装好,3 d换液1次,每周取出用滤纸擦干水分后称重(W2)。降解率=(W1-W2)/W1×100%。 2.3.3 细胞增殖度检测 参照李静等的方法,简述如下:依据国家标准方法按照1 cm2/ml比例用1640培养液浸提7组材料制备浸提液,将(购自北京协和基础所细胞中心)V-79中国仓鼠细胞种植于96孔板,分为8组:阴性组(单纯培养液)、10 min组、30 min组、1 h组、2 h组、12 h组、24 h组、72 h组,每组8孔。37℃培养箱中培养48 h后观察细胞形态并做MTT检测。根据所测定的各组OD值按照下述公式分别计算各实验组细胞相对增殖度(RGR):RGR=试验组平均OD值/阴性对照组平均OD值×100%。按照表1将各组的RGR转换成6级细胞毒性以评定材料的毒性程度(见表1)。 2.4 统计 用SPSS v11.5软件进行数据分析,参数值用均数和标准差(xˉ±s)(xˉ±s)表示,各组间比较采用单因素方差分析。 3 结果 3.1 医疗衔接度:n 随时间延长交联度增加,交联10 min时,交联度只有26.7%;交联30 min时,交联度为45.7;交联72 h时,交联度为73.1%(见表2)。 3.2 两组的溶胀度 随时间延长溶胀度降低,10