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黄芪对表皮干细胞增殖活性的调控作用 0 皮肤表皮干细胞增殖活性的认识和实践 严重烧伤、伤口、糖尿病局头皮炎和肿瘤切除通常会导致皮肤组织的广泛缺陷。目前，传统的临床治疗方法包括异体皮移植或异体皮移植，但自身皮肤的来源有限。异体皮和异体皮移植仍存在一定的免疫排斥反应，传播疾病的风险，以及临床应用的需要。近期研究证实,表皮干细胞具有自我更新、强大增殖和分化潜能,是皮肤及其附属器发生、修复与重建的关键源泉。凡能提高表皮干细胞增殖活性的药物和因素,对促进皮肤伤口愈合均具有重要意义。利用干细胞技术修复创面是当前医学领域伤口愈合治疗的重要策略,寻找增强皮肤表皮干细胞增殖活性的安全有效方法尤为必要。 黄芪是豆科多年生草本植物膜荚黄芪和蒙古黄芪的根,为中药中的补气药,性温味甘,入肺、归脾经,具有扶正固本、益气活血、延缓衰老等作用。中国药典记载黄芪化学成分众多,主要含有皂苷类、黄酮类、多糖类等有效成分,黄芪甲苷的化学结构式如下: 课题组以往研究发现,黄芪对人表皮体外扩展生长具有促进作用,并能诱导表皮干细胞增殖,具有修复皮肤缺损结构和功能的应用前景。实验拟进一步探讨黄芪对人皮肤表皮干细胞增殖活性的调控作用。 1 人表皮干细胞端粒酶反转录酶免疫细胞化学检测 设计:细胞学体外观察。 时间及地点:于2005-09/2008-06在南昌大学第一附属医院完成。 材料:烧伤整形患者植皮剩余皮片来源于南昌大学第一附属医院烧伤中心,患者对实验知情同意。黄芪注射液为正大青春宝药业有限公司产品,批号0207114,是从黄芪中提取的有效成分精制而成,黄色或棕色的澄明液体,p H 6.0~7.5,每毫升含黄芪甲苷≥1.0 mg,相当于含生药2 g。 实验方法: 表皮干细胞的分离培养:磷酸盐缓冲液漂洗皮片,用胰蛋白酶和EDTA联合消化法分离表皮,制成单细胞,以含表皮生长因子5μg/L、角质细胞无血清培养液组成的表皮干细胞培养液悬浮,接种于预铺有Ⅳ型胶原的培养板中,置37℃、体积分数为5%的CO2饱和湿度恒温培养箱中孵育10 min,吸出培养液和未贴壁细胞,实验组加入含40 g/L黄芪的表皮干细胞培养液继续培养,对照组单纯加入表皮干细胞培养液。 克隆形成率测定:将两组细胞分别消化分散成单细胞悬液,按200个细胞/孔接种到6孔培养板中,继续培养2周后行姬姆萨染色,显微镜下观察,进行细胞克隆计数,计算克隆形成率。 细胞周期测定:将两组细胞分别消化成单细胞悬液,调整细胞浓度至2×109L-1,用体积分数为70%的冷乙醇4℃固定20 min,预冷PBS洗涤,加RNA酶37℃水浴20 min,加碘化丙锭染液避光孵育30 min,FACS Calibur流式细胞仪自动检测细胞周期。激发光源为15 m W氩离子激光,激发波长为488 nm。 免疫细胞化学法检测:待第2代细胞形成明显克隆后,以En Vision两步法分别行端粒酶反转录酶免疫细胞化学染色,具体步骤按试剂说明书进行。同时设不加一抗的阴性对照。 端粒酶反转录酶表达定量分析:取两组细胞端粒酶反转录酶免疫细胞化学染色玻片各3张,采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文报告分析系统进行图像分析,去除背景着色,每张玻片随机选取5个视野,测定其吸光度和阳性细胞面积,取其平均吸光度值(以A表示)和阳性面积值(以S表示)。 主要观察指标:(1)表皮干细胞的增殖、克隆及细胞周期。(2)人表皮干细胞端粒酶反转录酶免疫细胞化学染色结果及其表达定量分析。 设计、实施、评估者:设计和评估为第一作者,干预实施为全部作者。均经过系统培训,未使用盲法评估。 统计学分析:由第一作者用SPSS 10.0软件进行统计处理,计量资料以表示,两样本均数比较行t检验分析,P0.05为差异有显著性意义,P0.01为差异有非常显著性意义。 2 结果 2.1 细胞克隆形成 筛选培养的表皮干细胞呈贴壁生长,3~5 d后形成小克隆,10 d左右有大的细胞克隆形成,见图1,2。 含黄芪的实验组人表皮干细胞克隆形成率明显高于对照组,见表1。 2.2 细胞周期分析 2.3 人类表面干旱酶反应培养酶的化学染色结果 2.4 人类表面干旱酶反转移酶的发现分析 图像定量分析法检测结果显示,含黄芪的实验组平均吸光度值和阳性面积值均明显高于对照组,见表3。 3 黄山胞菌细胞化学染色结果 克隆形成率和G0/G1期细胞比例是干细胞特性的重要要标标志志。。实实验验结结果果显显示示,,含含黄黄芪芪的的实实验验组组人人表表皮皮干干细细胞胞克隆形成率和G0/G1期细胞比例均明显高于对照组,提示黄芪有助于维持人皮肤表皮干细胞的特性。近期研究发现,表皮干细胞在体外寿命短暂,很容易失去干细胞特性而发生终末分化。如果能够在体外较好地调控表皮干细胞的增殖分化,维持其干细胞特性,延长其寿命,则对于创面修复和构建组织工