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dmem冻存液对小鼠细胞因子的影响 家蚕和胚胎的冷冻保存技术为畜牧业带来了显著的经济效益。生殖细胞是动物物种生存、进化和变异的基础,随着生殖细胞的体外培养、异体移植及遗传操作技术,以及体外胚胎生产技术等各项技术的进一步发展,各类生殖细胞的冷冻保存对于动物种质资源的长期保存及开发利用具有重要意义。目前,除精液冷冻保存研究及应用较为深入和广泛外,其余各分化阶段的生殖细胞以及生殖组织、器官的冷冻保存研究报道较少,资料缺乏。除少数几种动物睾丸单细胞冷冻保存有报道外,哺乳动物生精小管及睾丸组织块的冷冻保存在国内外报道极少。本研究在DMEM/10% NBS中添加10% DMSO,对7日龄小鼠生精小管及完整睾丸进行冷冻保存、测定细胞复苏率,探讨7日龄小鼠生精小管及完整睾丸的冷冻保存方法。 1 材料和方法 1.1 实验动物 6～7日龄雄性昆白系仔鼠。 1.2 dmem、dibco 小牛血清(NBS,Gibco),DMEM(Gibco),胰蛋白酶(Sigma), 二甲基亚砜(DMSO,天津市化学试剂一厂,分析纯)。 1.3 冷冻溶液的制备 在DMEM培养液中添加10% DMSO,10% NBS及50 μg/mL双抗,0.22 μm微孔滤膜过滤除菌,4 ℃冰箱保存备用。 1.4 细胞复苏率的测定 7日龄雄性仔鼠被处死后,迅速从其体内无菌取出睾丸,置预先加有适量PBS (pH 7.4) 的培养皿中,去白膜后PBS吹打,清洗3次以去除间质组织;800 r/min离心3 min收集生精小管; 加入15倍体积冻存液后,移入1.5 mL冷冻管,置-70℃冰箱内过夜,次日将冷冻管移入液氮,保存1周至半年。复苏时,从液氮中取出冷冻管,空气中停留片刻,投入37 ℃水浴至溶解; 用PBS离心(800 r/min,3 min)洗涤生精小管2次;10倍体积0.25%胰蛋白酶34 ℃消化10～15 min,其间吹打数次;DMEM /10%NBS终止消化,800 r/min,3 min离心洗涤细胞2次; 1%台盼蓝染色5 min,用血细胞计数板在倒置显微镜下随机取数个视野,统计死、活细胞数(细胞圆而透明,台盼蓝拒染者为活细胞,台盼蓝染色者为死细胞,每个样统计细胞总数不低于1 000个),计算细胞复苏率。以生精小管单细胞的复苏率为对照(冷冻保存方法见参考文献。 1.5 睾丸的制备 7日龄雄性仔鼠被处死后,迅速从其体内无菌取出睾丸,放入预先加有适量PBS的培养皿中;将睾丸清洗后移入1.5 mL冷冻管中,加入15倍体积的冻存液;将冷冻管置-70 ℃冰箱内过夜,次日移入液氮,保存1周至半年。复苏时,从液氮中取出冷冻管投入37℃水浴至溶解,用适量PBS洗涤睾丸3次后,撕去白膜, PBS吹打,800 r/min,3 min离心洗涤2次;随后的消化、染色、计数及计算方法同前。 2 不同的细胞损失率,细胞复苏率结果见表1 新鲜分离的生精小管单细胞的活细胞率为(97.4±0.6)%。7日龄小鼠生精小管及完整睾丸冷冻保存后的细胞复苏率分别为 (87.3±2.6)% 和 (85.0±3.4)%,两复苏率之间差异不显著(P0.05);与对照组单细胞复苏率相比,均差异不显著(P0.05); 7日龄小鼠生精小管及完整睾丸冷冻保存过程中的细胞损失率分别为10.1%和12.4%。 7日龄小鼠生精小管及完整睾丸冻存后细胞复苏率可达85.0%以上,此结果显示在慢速冷冻时,DMSO有足够的时间和速度渗入到生精小管的各部,从而起到保护作用;对于7日龄小鼠完整睾丸,由于其体积小(约0.2 cm×0.2 cm×0.25 cm),尽管有结缔组织白膜包裹,但对DMSO的渗透并无较大妨碍,DMSO也能及时渗入到内部而起到保护作用。在复苏时,因睾丸体积小,其内部能够及时复温,使细胞尽快度过有害温度区以减少细胞死亡。本研究表明,采用含10%DMSO冻存液,两步慢速冷冻,液氮保存,37℃水浴复苏是保存7日龄小鼠生精小管和完整睾丸的一种适宜的冷冻保存方法。 3 不同冷冻保存方法对7日龄仔鼠生精小管原代克氏原螯虾细胞复苏率的影响 目前,生物体成功的低温保存多采用所谓的慢速冷冻,具体步骤是:先将细胞放入含有抗冻剂的溶液中进行预处理,接着用程序降温仪将上述细胞连同溶液以较慢的速度降温,降到一定的低温时,再快速降温至液氮温度,并长期保存在此温度下。慢速冷冻保存法的研究手段有两种:理论分析法和实验研究法。前者虽未从根本上解决问题,但却给降温程序的制定和实验结果的分析提供有用的指导。实验研究法,针对不同细胞使用不同抗冻剂,采用不同降温、复温程序进行实验,然后根据复温后细胞的存活率来判断这种低温保存程序是否有效。根据冷冻效果研究,从7日龄小鼠睾丸分离得到的单细胞,在慢速冷冻时,10%DMSO为效果较佳的抗冷冻剂浓度,细胞复苏率可达89.4%