一氧化氮合酶和细胞色素p450在生精小管中的表达及意义.docxVIP

一氧化氮合酶和细胞色素p450在生精小管中的表达及意义 关于一氧化氮基因（nos）和细胞色素p450芳香化酶对雄性sd大鼠睾丸间质细胞的发现和相关性，本研究组进行了详细研究（见参考文献）。对三种亚型（enos、inos、nos）和细胞色素p450的生精小管精母细胞进行了报告。 1 材料和方法 1.1 os、nas和p450芳香化酶 一抗:兔抗大鼠一氧化氮合酶三种亚型(eNOS、iNOS、nNOS)和P450(细胞色素P450芳香化酶)(北京博奥森生物工程有限公司提供);二抗:生物素化山羊抗兔IgG(北京博奥森生物工程有限公司提供)。 1.2 睾丸的制备 选用出生后21天雄性SD大鼠18只(本院动物中心提供,SPF级),室外喂养两周,于生后5周、7周和10周各取6只,麻醉后取材,置睾丸于中性福尔马林液(甲醛浓度为36%)中固定,石蜡包埋,制成6μm厚的连续切片。 1.3 生物素化方法 eNOS和P450均运用石蜡切片消化程序:石蜡切片经二甲苯及梯度酒精脱蜡,蒸馏水洗3次,置复合消化液中10 min,蒸馏水洗3次,滴加正常山羊血清封闭液封闭20 min,甩去多余液体不洗,加稀释的一抗(1∶100)4℃过夜,0.1 mol/L(pH7.4)PBS洗3次,每次2 min,滴加生物素化山羊抗兔IgG室温20 min,0.1 mmol/L PBS洗3次,每次2 min,滴加试剂SABC,室温20 min,0.1 mol/L PBS洗4次,每次5 min。DAB显色5～10 min。阴性对照用PBS代替一抗。 1.4 细胞计数及计数 阳性表达的细胞胞质被染成棕黄色,阴性表达的细胞胞质不显色。结果判定按染色细胞的数量比(阳性/总体)和染色深度进行半定量测定,染色细胞数量以每只大鼠取3张切片,每张切片随机取5个视野,计数每3个生精小管的阳性精母细胞数。染色细胞的数量记分规则:无着色细胞为0分;阳性精母细胞数与本视野所有精母细胞数之比小于1/3为1分;着色细胞数介于本视野所有精母细胞数的1/3～2/3为2分;着色细胞数超过本视野所有精母细胞数的2/3为3分。细胞染色深度按颜色深浅记分为:0分,1分,2分,3分。判定结果:二者相加除以2,0分阴性(-),0-1分弱阳性(+),1-2分阳性(++),2-3分强阳性(+++)。 1.5 统计分析 2 结果 2.1 雄性sd大鼠诞生后5周、7周和10周内，细胞核和p450 2.2 免疫组化效果，os和p450 出生后5W、7W和10W的大鼠睾丸组织eNOS和P450的免疫组化结果见图1、2。 2.2 出生后5周内，nos和nios的免疫组化结果 见图3。 3 enos与细胞色素p450在生精小管精母细胞中的表达一致性 本实验重点研究了在性成熟期(出生后5～10周)这段时间eNOS在大鼠睾丸组织的表达变化情况,其中对睾丸间质细胞e NOS和细胞色素P450的表达情况已被报道,现主要针对生精小管内精母细胞NOS和细胞色素P450的表达情况进行研究,是对汇报的进一步完善。而结果提示我们,成熟始动期(生后5周)时,两者强阳性表达,生后7周、10周表达较弱,eNOS和细胞色素P450在生精小管精母细胞中的表达差异在统计学上没有显著性,故可认为两者在生精小管精母细胞中的表达有关联性。 用t检验进行统计学处理。 见表1。 在成熟始动期,eNOS和细胞色素P450在睾丸间质细胞的表达一致关联性主要是为了使睾丸间质细胞在性发育期对睾酮水平的高低进行调控,那么eNOS和细胞色素P450在生精小管内精母细胞的表达的相互协调一致又是为了什么呢?精子的发生过程需要在生精小管中有合适浓度的雄激素水平,亦及在生精小管中雄激素水平的高低可能由生精小管内精母细胞进行调控,而参与调控的酶可能就有eNOS和细胞色素P450。而iNOS和nNOS并没有如此关联。这也说明参与此处NO合成的酶是eNOS,而非iNOS和nNOS,所合成的NO作为第二信使在分子水平进行调控。此外eNOS和细胞色素P450在生精小管内除精母细胞外的其他细胞的阴性表达也充分说明在生精过程中精母细胞时期是精子发生的关键期,可以通过NO和其它酶系来调控精子发生过程。 总之,无论睾丸间质细胞雄激素的合成还是精子的发生,都有NOS和细胞色素P450的参与,相互协调共同调控生精过程。另外,粗线期精母细胞在向圆形精子细胞的演变过程中,其与FSH的关系已为人们所认识,那么FSH、eNOS以及细胞色素P450之间又有怎样的关系纽带,还有待解开。