酵母双杂交系统筛选抗雌激素作用酚类物质的生物测试法.docxVIP

酵母双杂交系统筛选抗雌激素作用酚类物质的生物测试法 越来越多的研究表明，一些合成化合物在生物体中之后具有内源性干预作用，并影响野生动物的繁殖发育。具有内分泌干扰作用的化学物质中,其中一些是通过和雌激素受体结合而影响生物体生殖机能和生殖器发育的。目前筛选能和雌激素受体结合的化学物质的体外实验方法有受体结合活性法和将雌激素受体基因克隆到酵母和培养细胞的方法。受体结合活性法只表示了待测物质和受体相结合的活性,但无法区别化学物质通过和受体结合而诱导雌激素作用的促进作用和化学物质通过和受体结合而抑制内源性雌激素和受体结合的所谓抗雌激素作用。而利用了克隆有雌激素受体基因的酵母和培养细胞的实验系统的原理是:待测物质通过和受体结合后,在细胞内由发现基因传达情报,最后通过测定酶的诱导活性或细胞繁殖等与雌激素作用的信号,能够区分促进和抗雌激素作用的方法。但是到目前为止,利用体外生物检测法对内分泌干扰物质进行筛选的工作中,往往着眼于雌激素促进作用而很少有关抗雌激素作用的研究报道。 本研究建立了用酵母双杂交体系筛选物质的抗雌激素作用的方法,并用此方法对氯化三苯基锡及4-n-壬基酚、 2-sec-丁基酚、 2-羟基联苯、 3-叔丁基酚、 2-叔丁基酚以及4-乙基-2,6-二叔丁基酚等6种酚类物质(结构如表1)的抗雌激素作用进行了测试。 1 材料和方法 1.1 氯化三苯基锡的制备 实验用培养基为去除了亮氨酸和色氨酸的SD培养基,测定抗雌激素作用和毒性用的双杂交酵母基因工程菌株Y190由日本大坂大学西川淳一博士惠赠;所测定的酚类物质及氯化三苯基锡的标准物质均购买于东京化成和林纯药公司;三苯氧胺和4-羟基三苯氧胺(Sigma);二甲基亚砜(DMSO)(ACS级,AMRESCO);无氨基酸氮源和氨基酸(Sigma);显色剂o-nitrophenol-β-D-galactopyranoside(ONPG)(东京化成);溶菌酶Zymolyase(20 T;生化学工业,日本);BIO-RAD 550酶标仪,Nunc 96孔2条可拆酶标板;Jouan MR 18 22冷冻离心机。 1.2 dmso与dmso溶剂的配制 筛选抗雌激素作用的实验使用的是克隆有人类雌激素受体(hERα)的基因工程酵母菌株Y190。具体操作步骤同测定雌激素促进作用的方法相同,所不同的是在加入不同浓度的样品溶液的同时加入2.5 μl的200 nmol/L的溶解在DMSO中的雌二醇溶液。 其抗雌激素作用以待测物质对2 nmol/L雌二醇所诱导的β-半乳糖甘酶活性的抑制表示,计算公式如(1)式所示: 抑制率/%=(A-Ax)/A×100 (1) 其中A为2 nmol/L的雌二醇的β-半乳糖甘酶诱导活性,Ax为所测样品和2 nmol/L的雌二醇共存时的β-半乳糖甘酶诱导活性。 1.3 急性毒性实验 为了区分待测物质对雌二醇的β-半乳糖甘酶诱导活性的抑制作用,是由于化学物质自身的致死毒性引起酵母菌的死亡所造成的,还是化学物质的抗雌激素作用引起的,本实验同时还建立了待测物质对酵母菌急性毒性的实验方法。毒性测试实验中用醋酸锂法导入GAL4AD和鼠类p53的融合基因pVA3,GAL4AD和SV40large T-antigen的融合基因pTD1的酵母Y190菌株(YTOX)。在酵母双杂交系统中,p53和SV40large T-antigen之间显示出很强的相互作用,因此导入pVA3和pTD1的酵母菌,即使在没有雌二醇的情况下,也能观测到β-半乳糖甘酶诱导活性,而且其活性强度取决于酵母菌的浓度。具体操作步骤同前,其毒性的大小是以待测物质对β-半乳糖甘酶诱导活性的抑制来表示,并按式(1)计算。 2 结果与讨论 2.1 苯氧胺对-半乳糖甘酶诱导活性的影响 抗乳癌剂三苯氧胺及其代谢产物4-羟基三苯氧胺是典型的抗雌激素物质(结构如表1)。首先采用上述的抗雌激素筛选方法尝试了对此2种物质的抗雌激素作用活性的测试。图1表示了三苯氧胺及4-羟基三苯氧胺的剂量-效应曲线。从图中可以看出当三苯氧胺的浓度在10-5?mol/L时开始显示抗雌激素作用,在10-4?mol/L时的抗雌激素作用几乎达到100%,其对β-半乳糖甘酶诱导活性的抑制达到一半时对应的浓度(IC50)对数值为-4.73。而4-羟基三苯氧胺的浓度在10-7?mol/L时开始显示抗雌激素作用,在10-6?mol/L左右时的抗雌激素作用达到了100%,其IC50的对数值则为-5.98。 三苯氧胺和4-羟基三苯氧胺的急性毒性的实验结果也表示在图1上。从它们的酵母毒性剂量-效应曲线可以发现三苯氧胺和4-羟基三苯氧胺的半致死浓度LC50均大于其IC50。这样用本实验方法也证实了三苯氧胺及其代谢产物4-羟基三苯氧胺的抗雌激素作用。 2.2 氯化三苯基锡的用量 用同样