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水稻籽实中cd、pb结合形态及其稳定性研究 人们越来越关注食品中重金属的暴露。由于不同形式的重金属对动物和人类的毒性不同，从20世纪80年代以来，研究了食品中的重金属形式，如大豆、贝类、谷物等。我们还研究了水稻、小麦、谷物中cd、pb等有毒元素的存在形式。结果表明，粮食中的重金属主要与蛋白质结合。然而，由于水质变化、重金属提取物和酶消化的变化，环境条件恶化，重金属结合形式的稳定性。因此，研究食物中重金属的结合形式和稳定性对评估它们的毒性非常重要。 谷物等食品是人类的主食,人体吃食,先要经过蒸煮,食物进入人体胃里后会受到各种消化酶的作用. 在蒸煮和消化酶的作用下,食物中的蛋白质结构会发生改变,与蛋白质结合的重金属形态也会发生变化. 本文拟通过模拟实验,探讨蒸煮和消化酶等环境条件对蛋白质-Cd、Pb结合形态稳定性的影响,为进一步评价谷物中重金属的毒性提供依据. 1 材料和方法 1.1 样本来源 试验所选用的稻谷采自湖北省大冶铜矿区和云南兰坪县铅、锌矿山附近的污染农田. 1.2 样品的制备和测定 稻谷去颖壳,研磨,然后脱去脂肪,风干后称取适量,用0.05 mol/L Tris-HCl (pH 7.5)进行提取,样品与提取液之比为1∶10. 将提取液样品置于冰箱内10h后,在20000g的高速冷冻离心机中离心1h,取上清液于冰冻干燥箱内浓缩5倍. 取浓缩样品1mL用0.05 mol/LTris-HCl溶解,经Sephadex G75柱进行层析分离(2.0 cm×100 cm). 用0.02 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.5)进行洗脱. 用自动部分收集器(BS2-100)以4 mL/20 min的流速,每管收集4 mL洗脱液. 紫外分光光度计(BECKMAN DU-8B)测定洗脱液的紫外吸收峰(225 nm处),并同步测定洗脱液中的Cd、Pb浓度. 采用标准蛋白质曲线法测定洗脱液样品的分子量. 标准蛋白质为:牛血清蛋白(分子量66000)、鸡卵清蛋白(分子量45000)、胰蛋白酶(分子量24000)、细胞色素C(分子量12400)、胰岛素(分子量 5734),均为层析纯. 将标准蛋白质混合液与样品相同的方法经Sephadex G75柱层析,绘制蛋白质标准曲线. 1.3 蛋白质和凝胶层析分离 准确称取一定量的被研磨的稻米置于烧杯中,加适量的去离子水,在电炉上加热,煮熟成米饭. 然后,按步骤1.2的方法提取蛋白质和凝胶层析分离. 1.4 胃蛋白酶和胰蛋白酶的消化实验 1.4.1 输注trs-hcl溶液 胃蛋白酶溶液(16mg/L):称取胃蛋白酶160mg (Pepsin 1:10000,Sigma P7000,539 units/mg, 华美生物工程公司),溶于10mL 0.02 mol/L Tris-HCl溶液(pH 7.0). 胰蛋白酶溶液(30mg/L):称取胰蛋白酶300mg (Trypsin 1∶250,Lot No. BE2185,华美生物工程公司),溶于10mL 0.02 mol/L Tris-HCl溶液(pH 7.0). 1.4.2 凝胶层析分离 5mL冷冻干燥的水稻蛋白质提取液,分别溶于1mL胃蛋白酶溶液和1mL胰蛋白酶溶液,对照组分别加1mL无酶的0.02 mol/L Tris-HCl溶液,37℃恒温培养5h,然后按步骤1.2的方法凝胶层析过柱分离. 1.5 分析方法的确定 将凝胶层析洗脱液样品经硝酸、高氯酸消化后用石墨炉原子吸收分光光度计(GBC906,澳大利亚)测定其含量. 为了保证分析方法的准确性,采用了国家标准物质样品进行质量控制. 2 结果与讨论 2.1 糙米中cd、pb蛋白多肽的表观分子量 脱脂水稻籽实样品用0.05 mol/L Tris-HCl 缓冲液提取,并将提取液经Sephadex G75柱进行凝胶层析,对洗脱液进行紫外吸收测定并同步进行Cd、Pb浓度分析,其结果示于图1. 由图1看出,糙米的Tris-HCl可溶性组分经Sephadex G75柱分离得到3个明显的紫外吸收峰,分别出现在洗脱液第15管(1峰)、31管(2峰)和44管(3峰)处. 经与相同条件下的蛋白质曲线对照这3个峰的表观分子量分别为54.5KD、16.04KD和5.5KD. 从洗脱液中Cd、Pb的浓度分布看, 出现了2个明显的Cd、Pb峰,其出现位置恰与第1、3个紫外吸收峰相重合, 第2紫外吸收处也有少量Cd、Pb分布. 由此推断,糙米中Cd、Pb蛋白质(多肽)结合体的表观分子量为54.5KD和5.5KD. 2.2 cd、pb的浓度变化 图2为蒸煮后的水稻籽实Tris-HCl提取液的凝胶层析结果.与对照比较(图1),蒸煮后的洗脱液中原有的3个蛋白质紫外峰的OD值都明显变小,特别第1峰下降明显,在第3峰后原来没有紫外吸收的