高效液相色谱法测定还原型谷胱甘肽片中杂质氧化型谷胱甘肽.docxVIP

高效液相色谱法测定还原型谷胱甘肽片中杂质氧化型谷胱甘肽 还原型谷胱甘醇（gsh）是一种重要的抗氧剂，具有多种生理功能，广泛用于医药、食品等领域。GSH固体较为稳定, 但在水溶液中很不稳定, 在生产过程中易被氧化成为氧化型谷胱甘肽 ( GSSG) , 失去其原有的生物活性, 且有一定的致敏性［1 ～ 3］。因此, 控制GSH中GSSG的含量, 不但是GSH原料生产的关键, 也是GSH相关制剂生产控制的重点之一。还原型谷胱甘肽片用于治疗慢性肝炎, 为长期用药, 但现行质量标准中［4］, 并未控制其已知杂质GSSG的含量, 增加了用药的风险。本文建立了口服片剂还原型谷胱甘肽片中氧化型谷胱甘肽含量的测定方法, 现报道如下。 1 仪器和试剂盒 1.1 仪器 岛津LC-20A高效液相色谱仪 ( 包括四元泵、自动进样器、柱温箱、紫外检测器、二极管阵列检测器) ; 赛多利斯天平。 1.2 纯度及浓度 氧化型谷胱甘肽 ( 中国食品药品检定研究院, 批号: 140746-200801, 纯度93. 6% ) 。还原型谷胱甘肽片 ( 沈阳某公司提供, 批号: 121101、121102、121103) , 甲醇为色谱纯, 其余试剂均为分析纯, 试验用水为重蒸水。 2 供试品溶液0.3. 2. 1. 1 供试品溶液取样品20 片, 研细, 称取适量 ( 约相当于还原型谷胱甘肽30 mg) , 精密称定, 加流动相振摇使溶解并定量稀释制成每1 ml中约含还原型谷胱甘肽0. 3 mg的溶液, 滤过, 取续滤液作为供试品溶液。 2. 1. 2 对照品溶液称取氧化型谷胱甘肽对照品适量, 加流动相溶解并制成每1 ml中含6 μg的溶液, 作为对照品溶液。 2.2 流动相ph 采用Agilent TC-C18( 250 mm × 4. 6 mm, 5 μm) ;磷酸盐溶液 ( 取磷酸二氢钠6. 8 g, 庚烷磺酸钠2. 2 g, 加水溶解制成1 000 ml, 用磷酸调节p H至3. 0) -甲醇 ( 96∶ 4) 为流动相; 检测波长为210 nm; 流速为1. 0 ml·min－ 1; 柱温为30℃; 进样量为20 μl。 2.3 含量测定条件 按处方比例, 取不含还原型谷胱甘肽的各辅料, 精密称定, 加流动相溶解, 滤过, 作为辅料溶液。精密吸取供试品溶液、对照品溶液和辅料溶液各20μl, 按“2. 2”项色谱条件测定, 记录色谱图。结果表明, 辅料对氧化型谷胱甘肽的测定无干扰, 见图1。 2.4 流动相色谱法 取氧化型谷胱甘肽对照品14. 99 mg, 置25 ml量瓶中, 加水适量溶解并稀释至刻度, 作为对照品溶液储备液。分别取0. 125, 0. 25, 0. 5, , 1, 2 ml, 置50ml量瓶中, 加流动相稀释至刻度, 摇匀, 按“2. 2 ”色谱条件测定。以峰面积 ( A) 对浓度 ( C) 做线性回归, 得直线方程为A = 1. 96 × 104C + 4. 62 × 102( r =0. 999 9) , 结果表明氧化型谷胱甘肽在浓度为1. 403~ 22. 450 μg·ml－ 1的范围内线性关系良好。 2.5 精密度测试 取“2. 1. 2”项配制的对照品溶液, 连续进样6针, 得峰面积的RSD为0. 09% ( n = 6) 。 2.6 氧化型谷胱甘肽的制备 取121101 批样品40 片, 研细, 称取6 份 ( 每份约相当于还原型谷胱甘肽30 mg) , 按照供试品溶液的制备方法制备, 按“2. 2”项色谱条件进行测定, 测得氧化型谷胱甘肽平均含量为0. 39% , RSD为1. 9% ( n = 6) 。 2.7 氧化型谷胱甘肽的制备 在不同试验日期, 由不同试验人试验。取重复性项下的细粉, 称取适量 ( 约相当于还原型谷胱甘肽30 mg) , 共6 份, 按照供试品溶液的制备方法制备, 按“2. 2”项色谱条件测定, 测得氧化型谷胱甘肽平均含量为0. 39% , RSD为1. 7% ( n = 6) 。 2.8 氧化型谷胱甘肽对照品溶液 精密称取“2. 6”项下样品细粉 ( 约相当于还原型谷胱甘肽15 mg) , 置50 ml量瓶中, 分别加入“2. 4”项氧化型谷胱甘肽对照品储备液0. 2, 0. 25, 0. 3 ml各3 份, 加流动相至刻度, 摇匀, 滤过。 按“2. 2”项色谱条件测定。结果表明, 氧化型谷胱甘肽的平均回收率为98. 9% , RSD = 1. 5% ( n = 9) 。 2.9 流动相流动相的测定 取氧化型谷胱甘肽对照品储备液0. 5 ml, 加流动相至50 ml, 分别在0, 2, 4, 6, 8 h测定。结果表明, 对照品溶液在8h内稳定, 峰面积RSD为0. 8% ( n = 5) 。