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2023-10-07 发布于天津
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在质粒载体中进行平末端片段的克隆.docx

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在质粒载体中进行平末端片段的克隆佚名在质粒载体中进行平末端片段的克隆分别设立两个反应，用适当的限制性内切核酸酶消化1~10pg质粒DNA和外源DNA片段，使它们能产生平末端。苯酚：氯仿抽提与乙醇沉淀法纯化出已被消化的载体和外源DNA片段。分别用TE(pH8.0)重新溶解纯化出的两种DNA沉淀，使终浓度为100ng/ml。假设1bp相当于660Da，计算DNA的终浓度(pmol/ml)。将载体DNA去磷酸化。按下表将适量的DNA转移至无菌的0.5ml离心管管号DNAA和E载体1[60fmol(~100ng)]B外源插入片段2[60fmol(~10ng)]C和F载体1(60fmol)和外源插入片段3(60fmol)D线状载体(5’-磷酸化)(60fmol)G环状载体[60fmol(~10ng)]1载体DNA已进行去磷酸化2外源目的DNA可以连接接头。 3连接反应中，质粒载体和插入的DNA片段摩尔比一般为1：1。DNA的总浓度应约为10ng/pl。 a.A、B和C管中加入： 10X连接缓冲液1.0pl T4噬菌体连接酶0.5Weiss单位5mmol/LATP 5mmol/LATP 1.0pl HO 2 补至8.5pl 30%PEG8000 1~1.5pl b.D、E和F管中加入： 1.0|Jl1.0|Jl 1.0|Jl 1.0|Jl 补至8.5pl 1~1.5pl 5mmol/LATP HO 2 30%PEG8000 不加DNA酶连接反应体系置于16°C水浴温育过夜或20^水浴温育4h。用每份稀释的连接产物转化感受态大肠杆菌。转化时，应包括用标准方法制备的已知量的超螺旋质粒DNA作为对照，以检查转化效率。管号 DNA 连接酶（有/无）预期转化克隆数 A 载体1 + ~03 B 插入片段 + 0 C 载体1和插入片段 + 比F管高5倍 D 载体1 - ~0 E 载体2 _ 比D管高50倍 F 载体和插入片段 - 比D管高50倍 G 环状质粒 - 2X105 1去磷酸化2未去磷酸化3如果出现来自去磷酸化的载体DNA自身连接产物的转化子，是由于用碱性磷酸酶处理时未能除尽5’端的磷酸基。