基因工程基础知识.docxVIP

第一章基因工程第一节基因工程概述 一.基因工程的概念 操作环境 操作对象 操作水平 基本过程 结果 生物体外 基因 分子水平 剪切-拼接-导入…表达 人类需要的基因产物 由于基因工程是在DNA分子水平上进行操作，因此又叫做重组DNA技术二.基因工程的基本工具 （一）“分子手术刀”一一限制性核酸内切酶（简祢限制酶 来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。 功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核昔酸之间的磷酸二酯键断开。 结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端 （二）“分子针线”——DNA连接酶 分类：根据酶的来源不同，可分为E-coliDNA连接酶和T4DNA连接酶两类 功能：恢复被限制酶切开了的两个核昔酸之间的磷酸二酯键。 ★两种DNA连接酶（E?coliDNA连接酶和T4DNA连接酶）的比较： 相同点：都缝合磷酸二酯键 区别：E.coliDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能使黏性末端之间连接；T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端之间的效率较低★DNA连接酶与DNA聚合酶作用的比较 DNA连接酶 DNA聚合酶 不同点 连接的DNA 双链 单链 模板 不要模板 要模板 连接的对象 2个DNA片段 单个脱氧核昔酸加到已存在的单链 DNA片段上 相同点 作用实质 形成磷酸二酯键 化学本质 蛋白质 （三）“分子运输车”一一载体 载体具备的条件： 能在受体细胞中复制并稳定保存 具有一至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段插入； 具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。 基因工程常用的载体有：—质粒、噬菌体和动、植物病毒等。 最早应用的载体是质粒，它是细菌细胞中的一种很小的双链环状DNA分子。 三.基因工程的基本过程 （一）获得目的基因（目的基因的获取）获取方法主要有两种：①从自然界中已有的物种中分离出来，如可从基因文库中获取。 ②用人工的方法合成。 ★获得原核细胞的目的基因可采取直接分离，获取直核细胞的目的基因一般是人工合成★人工合成目的基因的常用方法有反转录法和化学合成法。 利用PCR技术扩增目的基因（1）PCR的含义：是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。 （2）目的：获取大量的目的基因（3）原理：DNA双链复制（4）过程：第一步：加热至90?95°CDNA解链为单链第二步：冷却到55?60C,引物与两条单链DNA结合第三步：加热至70?75C,热稳定DNA聚合酶从引物起始进行互补链的合成（5）特点：指数形式扩增（二）制备重组DNA分子（基因表达载体的构建）重组DNA分子的组成：除了目的基因外，还必须有标记基因 ★标记基因的作用：鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。 方法：同种限制酶分别切割载体和目的基因，再用DNA连接酶把两者连接。 （三）转化受体细胞（将目的基因导入受体细胞）转化的概念：是且的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 常用的转化方法： 将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是农杆菌介导转化技术（农杆菌转化法），其次还有基因枪介导转化技术（基因枪法）和花粉管通道技术（花粉管通道法）。 将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是显微注射技术。此方法的受体细胞多是受精卵将目的基因导入微生物细胞：也处理法。 （四）筛选出获得目的基因的受体细胞、培养受体细胞并诱导目的基因的表达（目的基因的检测与鉴定）首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA分子杂交技术。 其次还要检测目的基因是否转录出mRNA，方法是采用DNA分子杂交技术。 最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是采用抗原一抗体杂交技术。 有时还需进行个体生物学水平的鉴定。如抗虫或抗病的鉴定等。 第二节基因工程的应用 运用基因工程改良动植物品种最突出的优点是：能打破常规育种难以突破的物种之间的界限基因工程的应用 （1）植物基因工程：抗虫、抗病、抗逆转基因植物，利用转基因改良植物的品质。 （2）动物基因工程：提高动物生长速度来提高产品产量、改善产品品质，用转基因动物生产药物，用转基因动物作器官移植的供体等。 （3）基因诊断和基因治疗： 基因诊断：又称为DNA诊断，是采用基因检测的方法来判断患者是否出现了基因异常或携带病原体。 基因治疗：指利用正常基因置换或弥补缺陷基因的治疗方法。 实例：ADA基因缺陷症的基因治疗第三节蛋白质工程 蛋白质工程的实质：根据蛋白质的结构与功能之间的关系，通过改造基因，以定向改造天然蛋白质，甚至创造自然界不存在的、具有优良特性的蛋白质。 蛋白质工程的基本原理预期蛋白质功能f测定蛋白质三维空间结构f推测应有的氨基酸序列f找到对应的脱氧核苷酸序列（基因）f具有预期功能的蛋白质 蛋白质