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一种模式植物columna中caps标记的改进开发方法 在自然群体和突变群体中，大多数dna多态性是单磷酸多态性（spms），因此开发了许多检测smps的方法（meerson等人，1985；bailey制表，1991。 在CAPS技术中，根据已知基因序列设计的引物被用来扩增模板DNA，通过检测扩增序列中限制性酶切位点的增加和减少来检测多态性核苷酸(Konieczny and Ausubel,1993;Neff et al.,1998)。随着拟南芥基因组测序的完成(The Arabidopsis Genome Inititive,2000)，有大量的序列数据可被用来设计引物。理想的情况下，这些序列数据可使PCR的新分子标记的开发最经济(Hauser et al.,1998)。因此，在应用CAPS标记时，如何充分和经济地利用基因组或者基因序列是一个新颖、有趣的课题。但目前仅有几种改良CAPS方法在其它方面做了一些改进，例如d CAPS和Beye建立的ECAPS(Michaels et al.,1998;Baumbusch et al.,2001)。本实验力图建立一种改进的CAPS方法，以便在开发拟南芥新分子标记时能充分地利用Columbia(Col)基因组序列。这种方法首先在Col基因组的扩增区段进行限制性内切酶分析，筛选出在Col基因组的扩增区段存在酶识别位点并可能产生具有生态型特异性酶切图谱的候选酶，然后用这些候选酶进行实验筛选CAPS标记酶；只有在候选酶中找不到CAPS标记酶时，才用其它酶进行筛选。由于这种方法是基于基因组序列信息建立的并可以节约一部分酶的费用，故将其叫做ge CAPS(genome-based economic CAPS)。 1 材料和方法 1.1 酶消化系统的研究 1.2 数据的鉴定和分析 利用拟南芥整个基因组(BAC clones,DNA)的数据和TAIR BLAST 2.0软件包中的BLASTN工具，输入正向引物序列找出F11A12标记的开始点，输入反向引物序列找出F11A12标记的终止点。在输入正向引物序列(GGTGG TGAAG AAGGT GCTCG)并执行BLAST后，可得到在拟南芥基因组序列上的BLAST查询结果。同样也可得到在拟南芥基因组序列上反向引物序列(ATTGT AATTT GGGAG CTGGA CC)的BLAST查询结果。据此可以发现F11A12标记在BAC F11A12上，其位置是13 428～15 127。然后利用TAIR Quick Search去发现TAIR数据库中的F11A12 BAC克隆及其GenBank accession AC068900。复制在13 428～15 127区段的DNA序列，利用TAIR BLAST 2.0软件包中的酶切分析工具进行分析和显示酶切图谱。结果发现123个侯选酶在13 428～15 127区段有酶切位点(包括F11A12标记的酶RsaⅠ)，117个酶在13 428～15 127区段无酶切位点，并看到所有酶的名称和123个侯选酶的TAIR酶切图谱。TAIR站点上的酶切分析工具也可用于其它植物。某些具有酶切分析功能的软件也可用来进行酶切分析。 1.3 pcr扩增及电泳 正向引物:GGTGG TGAAG AAGGT GCTCG; 反向引物:ATTGT AATTT GGGAG CTGGA CC。 两种拟南芥生态型Ler和Cvi，各1个花序或1片叶用于提取DNA。DNA提取采用Bentsink等(2000)中的方法。DNA提取的温度条件与Kaundun等(2003)中的相似，由125μL提取缓冲液（0.35mol/L山梨醇,100 mmol/L Tris HCl,5 mmol EDTA,pH 7.5）、175μL lysis缓冲液(200 mmol/L Tris,50mmol/L EDTA,2 mol/L NaCl,2%(W/V)CTAB 200mL水)和30μL 10%(W/V)Sarkosyl组成的混合液先在65℃下预热5 min，用来提取DNA，每一个样品在65℃水浴中提取30 min，轻轻倒置样品试管3次。加入400μL(或700μL)氯仿/异戊醇(24∶1,V∶V)，充分混匀。在15 000 g下离心5 min后将样品管中的约270μL(或500μL)上清液转入另一个新试管。在新试管中加入等量的270μL(或500μL)冷的异丙醇(-20℃)，摇匀。在15 000 g下离心5 min后将上清液移去。试管中的DNA球用200μL(或500μL)冷的70%乙醇(-20℃)漂洗，将试管置于旋转真空干燥器中干燥10 min，取出试管加入25μL灭菌无离子水,在4℃冰箱中保存备用。PCR反应液(50μL)含有大约50 ng基因组DNA和49μL反