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普洱茶水提物的分离筛选及化学成分分析 20世纪80年代末的分离和评价联合技术为研究活动因素提供了有利的条件。高效液相色谱(HPLC)法在茶叶多酚测定中被广泛利用[1~3],尤其通过紫外光电二极管阵列检测器,能对各个分离峰的鉴定提供许多有用的信息。但对天然产物中活性成分的化学结构进行更准确的鉴定,还需借助更精密的仪器,如核磁共振仪(NMR)、近红外光谱(NIR)和液质联用(LC-MS)等。其中液质联用法以适当接口(例如电喷雾离子化(ESI)、大气压离子化(APCI)接口)传输至质谱仪,对粗提物成分提供分子质量和结构信息。 后发酵茶属我国特有的茶类,由于其独特的风味和保健功能,热销于国内外市场。以普洱茶为代表的后发酵茶与红、绿茶的主要区别在于前者经过特殊的加工工艺,在渥堆即“后发酵”的过程中形成了一些特异的多酚类物质(可能是儿茶素寡聚体为主的多酚类非酶性氧化产物)。中国科学院昆明植物所的研究人员从普洱茶中分离出一种高氧化的黑茶素类化合物(puerins),为普洱茶中存在特异多酚类物质提供了有力证据。鉴于普洱茶的特殊保健功能可能与其含有的特异多酚类物质(如儿茶素的寡聚体等)密切相关,因此有必要从化学组成和结构等方面对其进行研究。本文对普洱茶以及各萃取组分进行了体外清除自由基的能力测定;采用LC-MS法鉴定萃取组分中的活性成分,旨在了解我国后发酵茶独特的保健作用机理。 1 材料和方法 1.1 加样、本样的制备 普洱茶粉,自制。取普洱茶(由浙江省茶叶进口公司提供,产地云南)以1∶10、1∶5的茶水比例在沸蒸馏水中浸提2次(30 min),合并浸提液,真空冷冻干燥,得普洱茶粉(PTW)。表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG,纯度98%)与茶多酚(TP,纯度TP95%,EGCG40%)由浙江大学茶叶科技开发有限公司提供;二苯基苦基偕腙肼(DPPH)、儿茶素标样与茶黄素标样均购自Sigma公司;甲醇、乙腈(色谱纯)购自天津四友有限公司;其余试剂均为国产A.R级。 1.2 高效液相色谱分析 LCMS-2010高效液质联用色谱仪(日本Shimadzu公司)配有LC-10AD泵、SPD-M10A二极管阵列检测器、DGU-14AM脱气装置、SIL-HT A自动进样器、CTO-10AS柱温箱、LCMS-2010 A质谱、干燥气体控制器、SLP-221CD压缩机(Anest Iwata Corporation,日本)与LCMS solution version 2.04色谱分析软件。 1.3 萃取组分的提取 取40 g普洱茶粉,用蒸馏水(质量比1∶10)配成溶液,倒入分液漏斗中,分别用等体积的氯仿、乙酸乙酯,正丁醇各萃取3次,每次萃取2 h。氯仿萃取后所得氯仿层为PCF,乙酸乙酯萃取后所得乙酸乙酯层为PEAF,正丁醇层为PBF。正丁醇萃取后所得水层加乙醇至最终体积分数为75%,得到沉淀物PD与剩余相PR。将各萃取层旋转蒸发去除有机溶剂后转溶于水中,冷冻干燥得各萃取组分。萃取流程见图1。 1.4 方法 1.4.1 火炬对加样样品od测定的不同方法 将溶于甲醇的DPPH(浓度1 mmol/L)0.8 m L,与2.4 m L不同浓度的普洱茶各萃取组分的甲醇溶液混合,充分混匀后于暗室(室温)中放置30 min,在517nm下测定吸光值OD样品。以甲醇代替各样品溶液作为对照测得吸光值ODck,DPPH清除率计算公式为: DPPH清除率(%)=(ODck-OD样品)×100/ODck。 1.4.2 流动相a5e HPLC-MS仪器中HPLC部分:UG120 C-18柱:2.0 mm×150 mm,5μm(日本Shiseido公司);检测器波长200~600nm,柱温35℃,流速0.2 m L/min,进样量10μL;流动相A为乙酸、乙腈和重蒸水(体积比0.5∶3∶96.5);流动相B为乙酸、乙腈和重蒸水(体积比0.5∶30∶69.5);洗脱梯度:0~45 min B流动相由0%~100%,45~60 min B流动相为100%。 HPLC-MS仪器中MS部分:离子源:ESI(电喷雾),含正、负离子,质量范围100~900 m/z。干燥气体流速1.5 L/min,毛细管电压1.5 k V,干燥温度250℃。 1.4.3 统计方法 2 结果 2.1 加标回收法dpph各萃取组分对dpph自由基的清除效果 由表1可知,在DPPH反应体系中,各萃取组分浓度的对数与清除率存在线性关系(P0.05)。由线性方程得出的抑制50%DPPH时所需浓度(IC50),可以了解普洱茶水提物及其各萃取组分对DPPH自由基的清除效果,其由强到弱依次为PEAFPBFPTWPDPR。PEAF具有最强的抗氧化性,对该组分进行活性成分的鉴定。 2.2 黄酮苷类物质的鉴定 图2是PEAF的HPLC分析