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双击数据分析软件图标,打开数据分析软件,在软件Data Selection界面左下侧子窗口路径下选中待分析kinetics数据,双击后载入左上侧子窗口Loaded Data Kinetics文件夹下:
左键单击所载入待分析数据,右侧窗口显示Sensor Tray按钮下界面,即该检测中sensor所在sensor tray上位置,在此可选择分析哪些sensor采集的数据,本例分析所有sensor的数据
该窗口另一个按钮Summary按钮下界面如下,包括实验运行信息,检测程序的步骤及时间、板孔排列等。
选择所需分析sensor后,点击Processing进行数据处理:
数据处理界面如下,该窗口左侧依次包括Step1:Data Selection,Step2:Subtraction,Step3:Align Y Axis,Step4:Inter-step Correction,Step5:Process,Step6:View Results,Step7: Save Results;右侧窗口默认为Raw Data View下界面,即原始数据预览。
点击Step 1下Sensor Selection按钮,界面如下:
对于经典小分子实验,在实验设计上包括sensor对照和孔对照(间经典小分子实验设计SOP),数据处理时需分别扣除对照孔及对照sensor引入的干扰;选中对照孔,右键下选择Change Well Type…下的Refference Well:
设置Refference Well后界面如下:
在Sensor Tray下选中对照Sensor,右键选择Change Sensor Type…下的Refference Sensor:
设置Refference Sensor后的界面如下:
在Step 2下选中Double Subtraction,即扣除对照空及对照sensor可能引入的干扰:
在Step 3下Step框下拉菜单中选择Baseline,起止时间可采用默认时间,也可适当将起始时间调整至靠近中止时间5~10s(尤其在基线起始段有跳动或未平整时)。注意:对于需要分析结合解离等参数样品,必须设置Baseline步骤!
勾中Step 4后小方框,选择Align to Dissociation,该步骤适用于解离与基线检测在相同板孔中进行,可理解为交互步骤校正。注意:如果实验设计中基线与解离在不同板孔中进行,不需勾中Step 4后方框!
如上数据处理参数设置完毕后,点击Step 5下Process Data按钮,处理数据;数据处理完毕如上图;
点击Analysis进入数据分析界面,如上图,该窗口左侧主要分析参数依次为:1.Curve Fitting(曲线拟合),包括Step to Analyze(需分析步骤)下Association Only(仅结合)、Dissociation Only(仅解离)及Association and Dissociation(结合和解离);Model(拟合模型)下1:1及2:1等模型; Fitting(拟合)下Local【Full和Partial】,Global(Full)【Group by(按…分组,含Sensor和Color)和Rmax Linked Rmax Unlinked by(sensor和Compound)】;Window of Intetrest(From Start of Step)(欲分析时间区段);Fit Curve按钮;2.Steady State Analysis(稳态分析)。
以本案为例,具体地:
Step to Analyze下选择Association and Dissociation(结合和解离),计算结合常数(kon)、表观结合常数(kobs)、解离常数(koff) 及解离平衡常数(KD)等。注意:结合常数(kon)及解离平衡常数(KD)的计算必须输入样品浓度! 对于简单排序(Rank)或筛选类实验也可根据需要仅仅分析Dissociation Only(仅解离),不需要浓度即可完成。
Model(拟合模型)下选择1:1模型(除非已知某特定模型);注意:如采用1:1模型分析后数据异常,如曲线形状不是典型的1:1曲线或拟合度不高等,首先应该考虑实验优化甚至样品原因。
Fitting(拟合):本例中选择Global(Full),即群组分析,由于本例中需考察各样品完整、准确动力学参数,因此设置了浓度梯度,各梯度间数据存在关联性,因此采用群组分析;注意:本例对多个样品一次性分析,各样品采用相同类型的sensor检测,因此按照颜色区分,及Group by Color。同时选择Rmax Linked,由于经典小分子实验中其动力学特征表现为快上快下,解离充分,因此可认为检测各浓度下动力学
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