北极海泥中抗菌活性海洋真菌的筛选与初步鉴定.docxVIP

北极海泥中抗菌活性海洋真菌的筛选与初步鉴定 从海洋微生物中寻找草药已成为开发药物资源的重要策略之一。国内外对海洋细菌和放线菌的活性天然产物的研究起步较早,发现的新化合物数量也较多,相比之下对海洋真菌的系统研究起步较迟,直到20世纪90年代才进入较快速的发展阶段。目前,人们已经从海洋真菌的发酵产物中发现了1000多种新的次生代谢产物,这些代谢产物呈现出良好的抗肿瘤、抗菌、抗病毒等生物活性,成为当前海洋药物研究的热点。 作者从北极海泥中分离真菌,采用其发酵液进行抗菌活性筛选,并鉴定其种类、研究其活性代谢产物的性质,以期发现具有显著抗菌活性的菌株,为建设海洋真菌种质资源库、开发新的微生物药物奠定基础。 1 实验 1.1 材料表面 1.1.1 样本来源 北极海泥来自北极黄河站附近海域潮间带。 1.1.2 菌株来源atcc 金黄色葡萄球菌(Staphyloccus aureus)ATCC 25925、大肠杆菌(Escherichia coli)ATCC25922、多株金黄色葡萄球菌临床分离耐药菌、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、白色念珠菌(Candida albicans),均由中国药科大学微生物学实验室提供。 1.1.3 主试剂 DNA Marker、Taq MasterMix,康为;引物由上海生工合成;其它试剂均为国产分析纯。 1.2 培养基 1.2.1 培养基的制备 马铃薯葡萄糖琼脂培养基:马铃薯去皮,200 g切成小块,加水煮沸30 min,4～6层纱布过滤,加20 g葡萄糖、20 g海盐、15～20 g琼脂,蒸馏水1000 mL。 察氏培养基:NaNO32 g,K2HPO41 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,KCl 0.5 g,FeSO4·7H2O 0.01 g,蔗糖30 g,海盐20 g,琼脂15～20 g,蒸馏水1000 mL。 沙氏培养基:蛋白胨10 g,葡萄糖4 g,琼脂15～20 g,蒸馏水1000 mL。 改良的马丁培养基:葡萄糖20 g,蛋白胨5 g,酵母粉 2 g,K2HPO41 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,海盐20 g,琼脂15～20 g,蒸馏水1000 mL。 葡萄糖酵母膏蛋白胨琼脂培养基:葡萄糖10 g,蛋白胨2 g,酵母膏0.5 g,海盐20 g,琼脂15～20 g,蒸馏水1000 mL。 1.2.2 指示器菌的培养基 营养琼脂培养基:蛋白胨 10 g,牛肉膏 3 g,氯化钠 5 g,琼脂 15～20 g,蒸馏水1000 mL。 1.2.3 发酵培养基 种子发酵培养基:马铃薯葡萄糖液体培养基。 发酵培养基:察氏液体培养基。 1.3 方法 1.3.1 菌落纯化和纯化 采用平板稀释法分离菌株。取海泥样品1 g,用无菌海水逐级稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5数量级,各取0.2 mL均匀涂布于分离平板上,每个稀释度涂3个平板,28 ℃倒置培养,每天观察是否有新菌落出现,挑取形态相异的菌落划线纯化,纯化的菌株斜面置于4 ℃冰箱保存。 1.3.2 种子培养 从活化斜面中取菌丝块或孢子接种于装有50 mL种子培养基的250 mL 摇瓶中,28 ℃、200 r·min-1下培养3 d作为种子。将种子以8%的接种量接入装有 100 mL发酵培养基的500 mL摇瓶中,28 ℃、200 r·min-1下培养7 d。将发酵液用低温高速离心机8000 r·min-1离心20 min,取上清布氏漏斗抽滤,得到澄清发酵液,用无菌的0.22 μm 滤膜过滤,得无菌体的澄清发酵液,4 ℃冰箱保存。 1.3.3 抑菌圈的测定 采用滤纸片法进行抗菌实验。用无菌水将斜面培养的指示菌洗下,与适量培养基混匀倒平板,将含有待测样品的无菌滤纸片贴于平板上,细菌培养24 h,真菌培养48 h,观察是否有清晰透明的抑菌圈产生,并测量抑菌圈的直径大小。 1.3.4 5、细菌的识别 1.3.4. 1.培训的特点 采用标准条件培养菌株,观察并记录 PDA平皿菌落特征,包括菌落的正背面颜色、菌落直径、菌落质地、有无分泌物等。 1.3.4. 2.微观形态观察 挑取菌株产孢器及菌丝制成水封片,吕氏碱性美蓝染色,进行镜下观察,记录菌丝特征及分枝情况、孢子和产孢器结构等。 1.3.4. pcr和测序 采用改良的CTAB法提取基因组DNA。 ITS序列的PCR扩增采用通用引物:ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)。PCR扩增条件:95 ℃预变性4 min,95 ℃ 30 s,55 ℃ 40 s,72 ℃ 1 min,循环30次,72 ℃ 延伸8 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶检测,纯化后交南京思普金公司测序。 将测序