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高通量测序技术在基因组学中的应用 20世纪70年代，franerice发明的双脱氧链最终过程酸分析技术为科学发展做出了重要贡献，实现了人类谱系的完成。Sanger测序法也被称为第一代测序技术,它的原理是以DNA单链为模板,进行PCR扩增,扩增体系中加入的碱基为d NTP和荧光dd NTP,对得到的不同长度产物进行电泳分离和激光诱导荧光颜色区分,经过信息转换,获得长达800 bp的DNA链碱基组成序列。该方法已经在PCR产物、载体克隆测序等方面得到广泛应用,但其成本高和测序通量低的缺陷,限制了该方法在大规模测序中的应用。 新一代测序技术(next-generation sequencing technology,或被称为第二代测序技术)以Illumina公司的Solexa,ABI公司的SOLi D,和Roche公司的454技术为代表。这些测序平台以数据产出通量高为最大特点,以Solexa技术为例,采用了该技术的Hi Seq 2000测序仪,一台机器在两周内就可以产出超过300G的数据,相当于把人类基因组重复测100遍以上。这完全改变了过去的研究模式,给人类和动植物基因组学、转录组学、宏基因组学研究等方面带来全新的变化,并逐步深入到微生物学研究领域中。本综述旨在介绍代表性的高通量测序技术,同时着重阐述该技术在微生物学研究中的应用。 1 高流量研究技术介绍 1.1 同聚物和重复序列的检测 IIllumina公司的新一代测序仪(包括Genome Analyzer及其升级版Hi Seq 2000)利用基于单分子簇的边合成边测序技术(Sequencing by Synthesis,SBS)和专有的可逆终止化学反应,可以在短时间内获得大量数据。该测序技术将基因组DNA的随机片段附着到光学透明的玻璃表面,这些DNA片段经过延伸和桥式扩增,形成了具有数以亿计Clusters的Flow cell,每个Cluster就是具有数千份相同模板的单分子簇;然后对这些模板使用可逆终止并可移除的四色荧光染料,进行边合成边测序。这种新方法确保了高精确度和真实的单碱基连续测序,为同聚物和重复序列的测序难题提供了很好的解决方案。 测序特点:(1)通量高。目前一台机器在两周内最高可产出360G的数据;(2)准确率高。≥98.5%,同时也有效地解决了多聚重复序列的读取问题;(3)成本低。低于传统Sanger测序技术成本的1%;(4)DNA序列的读取长度不断增加,当前单条序列读长可达到150 bp;(5)可以进行Pair-end(PE)双向测序,PE文库插入片段大小范围可由150 bp到10 kb。正确选择插入片段长度有利于高重复序列含量基因组的组装,这进一步扩展了该技术的应用范围。 1.2 通过“picotiterples”测序确定碱基序列 2005年底,454公司推出了革命性的基于焦磷酸测序法的超高通量基因组测序系统———Genome Sequencer 20 System,被《Nature》杂志以里程碑事件报道,开创了新一代测序技术的先河。最新的Roche GS FLX测序仪使用了一种叫做“Pico Titer Plate”(PTP)的平板,含有160多万个由光纤组成的孔,每个孔中载有一个乳化扩增(Emulsion PCR)过的DNA单拷贝磁珠,还有化学发光反应所需的各种酶和底物。测序时4种碱基依照T、A、C、G的顺序循环进入PTP板。如果发生碱基配对,就会释放一个焦磷酸,经过合成和化学发光反应,光信号被高灵敏度CCD捕获到,就可以准确、快速地确定待测模板的碱基序列。 测序特点:(1)速度快。一个测序反应耗时10 h,获得4-6亿个碱基对。比传统的Sanger测序的方法快100倍;(2)读长长。单条序列的读长平均可达到450 bp;(3)通量高。每个反应可以得到超过100万个序列读长;(4)准确度高。读长超过400 bp时,单一读长的准确性可以超过99%;(5)可以进行PairEnd测序研究。 1.3 多聚核苷酸测序 AB SOLi D sequencer是由ABI公司研发的新一代高通量基因测序分析系统,该技术以用四色荧光标记寡核苷酸进行连续的连接反应为基础,能够对单拷贝扩增的DNA片段进行大规模高通量并行测序,根据双碱基编码原理进行数据比对。建库过程使用微反应板和乳液PCR/微珠富集。多轮测序反应和每轮多次连接反应,保证了每个碱基判读2遍,增加了序列读取准确性,使原始碱基数据准确度大于99.94%,而在15×覆盖率时准确度可达99.999%。测序特点:(1)可制备Mate-paired文库测序,插入片段范围600 bp-10 kb;(2)通量高,每台SOLi DTM4 System测序仪在15天内能够获得100 G的数据量;(3)采用Primer reset方